亚细胞定位之烟草转化方法
烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析
烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析李尊强;王春军;杨爱国;丁安明;冯全福;徐剑;焦惠鹏;高堃宇【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)030【摘要】[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析.[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况.[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP 融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达.[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据.【总页数】4页(P11957-11960)【作者】李尊强;王春军;杨爱国;丁安明;冯全福;徐剑;焦惠鹏;高堃宇【作者单位】牡丹江烟草科学研究所,黑龙江牡丹江157011;牡丹江烟草科学研究所,黑龙江牡丹江157011;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100【正文语种】中文【中图分类】S572【相关文献】1.东方百合‘演员’DXS基因的克隆与表达分析 [J], 张浩宇;樊俊苗;王婷;杜方2.烟草氧化胁迫相关基因NtOSA1的克隆表达及亚细胞定位分析 [J], 刘继恺;高永峰;吴婵娟;张林;陈彩霞3.马铃薯StPSKRs基因的克隆及其亚细胞定位分析 [J], 卢瑶; 胡金雪; 金鑫; 陈越; 陈勤; 卢海彬4.薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达 [J], 龚林涛;苏秀娟;尹松松;孙明辉;闫博文;阿迪莱·阿布都热依木;陈全家5.枳两个GRAS基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析 [J], 李阿英;刘洪;李晓颖;郭磊;宋长年因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位亚细胞定位是现代生物学研究的重要领域之一。
它通过对细胞内各种分子的运动和分布进行观察和分析，揭示了细胞内分子交互作用的复杂性和多样性。
烟草作为一种常见的植物，也是亚细胞定位研究的重要对象之一。
本文将从烟草亚细胞结构、亚细胞定位技术以及烟草亚细胞定位的研究进展等方面进行探讨。
一、烟草亚细胞结构烟草细胞是一种典型的植物细胞，由细胞质、细胞核、质膜、细胞壁、线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体和微管等多个不同的结构组成。
其中，细胞核是细胞的重要组成部分，包含着遗传信息和调控机制。
质膜是细胞的外层结构，维持着细胞内外环境的稳定。
细胞壁是细胞的支撑结构，保护细胞不受外界环境的侵害。
线粒体是细胞内能量的主要来源，参与细胞的呼吸作用。
叶绿体是植物细胞的特征性结构，参与光合作用。
高尔基体和内质网是细胞内蛋白质合成和转运的重要场所。
核糖体是细胞内蛋白质合成的基本单位。
微管是细胞内的一种细胞骨架，参与细胞的形态维持和运动。
二、亚细胞定位技术亚细胞定位技术是研究细胞内分子运动和分布的重要手段。
目前常用的亚细胞定位技术主要包括荧光显微镜技术、电子显微镜技术、蛋白质标记技术和基因工程技术等。
其中，荧光显微镜技术是最常用的亚细胞定位技术之一。
它利用荧光染料或荧光蛋白对细胞内分子进行标记，通过荧光显微镜观察细胞内分子的运动和分布。
电子显微镜技术则可以观察到更高分辨率的细胞结构和分子分布。
蛋白质标记技术和基因工程技术则可以对分子进行精确的定位和操作，提高亚细胞定位的精度和可靠性。
三、烟草亚细胞定位研究进展烟草作为一种常见的植物，其亚细胞定位研究也有着广泛的应用和深入的研究。
近年来，烟草亚细胞定位研究主要集中在以下几个方面：1.烟草亚细胞蛋白质定位烟草中有大量的蛋白质参与细胞的生长和发育过程。
通过荧光蛋白标记技术和基因工程技术，可以对这些蛋白质进行定位和操作。
研究表明，烟草细胞质内的微管蛋白可以定位在微管上，参与细胞的形态维持和运动。
亚细胞定位的实验报告
一、实验背景亚细胞定位是指某种生物大分子物质或脂类在细胞内存在的具体位置。
了解蛋白的亚细胞定位对于研究基因的功能、蛋白互作及其作用机理具有重要意义。
本实验旨在利用荧光蛋白原位鉴定法，观察目标蛋白在细胞内的具体位置，从而了解其亚细胞定位。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）烟草种子；（2）农杆菌（GV3101、EHA105、LB4404等）；（3）构建好的载体质粒；（4）亚细胞定位培养基；（5）10ml YEB液体培养基；（6）10mM MgCl2悬浮液；（7）1ml注射器；（8）激光共聚焦显微镜。
2. 实验仪器：（1）电子显微镜；（2）PCR仪；（3）电泳仪；（4）凝胶成像系统；（5）激光共聚焦显微镜。
三、实验方法1. 烟草培养：播种烟草种子，12h光照培养，培养一个月后用于实验。
2. 农杆菌培养：将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌，30℃培养2天。
3. 悬浮农杆菌：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，170rpm/min培养1h。
4. 收集菌体：4000rpm/min，离心4min，去上清。
5. 重悬：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调OD600至0.6左右。
6. 注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
7. 培养：将注射完成的烟草植株弱光培养2天，即可观察。
8. 观察：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
四、实验结果与分析1. 叶绿体荧光信号：叶绿体荧光信号激发波长为640nm，发射波长为675nm。
2. GFP信号：绿色荧光蛋白GFP，激发光波长为488nm，发射光波长为510nm。
根据实验结果，可以观察到目标蛋白在烟草叶片细胞内的具体位置，从而了解其亚细胞定位。
五、实验结论通过本实验，我们成功利用荧光蛋白原位鉴定法，观察了目标蛋白在细胞内的具体位置，实现了对其亚细胞定位的研究。
亚细胞定位步骤
亚细胞定位步骤
亚细胞定位的步骤主要包括以下几步：
1. 细胞准备：获取所需的细胞样本，可以是动物或植物细胞，也可以是微生物细胞。
2. 荧光标记：将目标蛋白质与荧光染料（如绿色荧光蛋白，GFP）进行标记，以便在显微镜下观察。
3. 细胞转染：将标记的目标蛋白质导入细胞中，可以使用不同的方法，如显微注射、电穿孔或脂质体转染等。
4. 显微观察：在荧光显微镜下观察细胞，寻找目标蛋白质在亚细胞结构中的位置。
通常需要使用不同倍率的物镜来观察不同大小的细胞和亚细胞结构。
5. 图像采集和分析：使用图像采集系统记录观察到的图像，并使用相关软件进行分析，以确定目标蛋白质在亚细胞结构中的位置。
6. 验证实验：为了确保结果的可靠性，需要进行一系列验证实验，如免疫共沉淀或Western blot等，以确认目标蛋白质与亚细胞结构的相互作用。
通过以上步骤，可以确定目标蛋白质在亚细胞结构中的位置，进一步了解其在细胞中的功能和作用。
亚细胞定位实验报告(3篇)
第1篇实验目的：本研究旨在通过亚细胞定位技术，确定目标蛋白质在细胞内的具体分布位置，为进一步研究该蛋白质的生物学功能提供实验依据。
实验材料：1. 目标蛋白质表达质粒2. 表达载体（如pEGFP-N1）3. 农杆菌（如GV3101）4. 烟草植株5. 激光共聚焦显微镜6. 其他实验试剂和仪器实验方法：1. 构建表达载体：将目标蛋白质基因与表达载体（如pEGFP-N1）连接，构建融合表达质粒。
2. 农杆菌转化：将构建好的融合表达质粒电转化农杆菌，获得转化子。
3. 农杆菌培养：将转化子接种于YEB液体培养基中，在170rpm/min的条件下培养1小时。
4. 农杆菌悬浮：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，悬浮农杆菌。
5. 收集菌体： 4000rpm/min，离心4分钟，去除上清。
6. 重悬菌体：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调整OD600至0.6左右。
7. 注射烟草：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
8. 培养烟草：将注射完成的烟草植株弱光培养2天。
9. 观察与拍照：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
实验结果：通过激光共聚焦显微镜观察，发现融合表达质粒中的绿色荧光蛋白（GFP）信号在烟草叶片中呈现明显的细胞内分布。
根据GFP信号的位置，可以初步判断目标蛋白质在细胞内的分布情况。
结果分析：1. 细胞核定位：若GFP信号主要分布在细胞核区域，则表明目标蛋白质定位于细胞核。
2. 细胞质定位：若GFP信号主要分布在细胞质区域，则表明目标蛋白质定位于细胞质。
3. 细胞膜定位：若GFP信号主要分布在细胞膜区域，则表明目标蛋白质定位于细胞膜。
根据实验结果，可以初步判断目标蛋白质在烟草细胞中的定位情况，为进一步研究其生物学功能提供实验依据。
讨论：1. 亚细胞定位实验是研究蛋白质生物学功能的重要手段之一。
亚细胞定位之烟草转化方法
亚细胞定位之烟草转化方法烟草是常见的植物模型，被广泛应用于植物生物学研究中。
研究人员通常通过烟草转化方法，将外源基因导入烟草中，实现对基因的功能研究或产生转基因烟草植株。
烟草转化方法通常包括两个步骤：外源基因构建和烟草转化。
首先，需要构建一个携带外源基因的转化载体。
这个载体通常包含一个启动子、外源基因和终止子。
启动子可以驱动外源基因的转录，终止子可使转录终止。
外源基因可以是一个编码蛋白质的序列，也可以是一个编码RNA或其他功能分子的序列。
构建好转化载体后，接下来可以通过烟草转化方法将其导入烟草中。
烟草转化方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法之一、农杆菌介导转化是利用农杆菌的特性，将外源基因导入烟草细胞中。
首先，需要将转化载体与农杆菌进行共转化，形成转化菌。
接着，将转化菌与烟草叶片进行共同培养，利用农杆菌T-DNA的转移机制，将外源基因导入烟草细胞中。
经过一段时间的培养，将转化的烟草细胞分离培养，最终获得转基因烟草植株。
利用亚细胞定位技术，可以进一步研究转基因烟草植株中外源基因的定位。
常用的方法包括荧光蛋白标记技术和抗体标记技术。
荧光蛋白标记技术可以通过将外源基因与荧光蛋白基因进行融合，使转基因植株产生荧光蛋白标记，从而观察外源基因在细胞内的定位。
抗体标记技术则是将外源基因编码的蛋白质与特异性抗体结合，通过免疫荧光染色等方法观察外源基因的定位。
通过亚细胞定位技术，可以了解转基因烟草植株中外源基因在不同亚细胞位置的分布。
这对于研究外源基因的功能以及其与其他生物分子的相互作用方式非常重要。
此外，亚细胞定位研究也可以为转基因烟草的功能性研究提供重要线索。
总结起来，烟草转化方法是利用烟草作为植物模型，将外源基因导入烟草中的方法。
通过亚细胞定位技术，可以了解外源基因在转基因烟草植株中的定位，进一步研究外源基因的功能和相互作用方式。
烟草转化方法为研究转基因植物提供了重要的工具和方法。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位烟草是一种广泛栽培的经济作物，也是一种重要的研究材料。
在过去的几十年中，人们对烟草的生物学特性进行了广泛的研究，其中包括烟草细胞的亚细胞定位。
烟草细胞的亚细胞定位是指确定细胞内特定分子的位置和功能的过程。
通过这种方式，我们可以更好地理解烟草细胞的生物学特性，进而为研究其他生物提供有益的参考。
烟草细胞的结构在研究烟草细胞的亚细胞定位之前，我们需要先了解烟草细胞的基本结构。
烟草细胞是一种真核细胞，其结构包括细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体等。
其中，细胞膜是细胞的外层保护层，细胞质是细胞内部的液体环境，细胞核是细胞内的遗传物质和控制中心，线粒体是细胞内的能量中心，内质网是细胞内的蛋白质合成和质膜合成中心，高尔基体是细胞内的物质分泌中心，溶酶体则是细胞内的垃圾处理中心。
这些结构之间相互作用，共同维持烟草细胞的正常生理功能。
烟草细胞的亚细胞定位技术烟草细胞的亚细胞定位技术是通过染色、免疫共沉淀、免疫荧光等方法来确定细胞内特定分子的位置和功能。
其中，染色技术是最早被使用的技术之一，通过染色剂将细胞内不同的结构染色，从而确定它们的位置和功能。
例如，用荧光染料DAPI染色可以清晰地观察到烟草细胞核的位置和形态。
免疫共沉淀技术是一种通过抗体识别特定蛋白质并将其与其他相关蛋白质共同沉淀下来的技术。
这种技术可以用来确定蛋白质之间的相互作用关系，从而进一步了解它们在细胞内的功能。
例如，通过免疫共沉淀技术可以确定烟草细胞质中的一些关键蛋白质与细胞分裂和细胞骨架形成的关系。
免疫荧光技术是一种通过抗体与荧光染料结合的方式来定位特定蛋白质的技术。
这种技术可以用来确定蛋白质在细胞内的位置和运动方式，从而进一步了解它们在细胞内的功能。
例如，通过免疫荧光技术可以确定烟草细胞质中的一些关键蛋白质与细胞分裂和细胞骨架形成的关系。
烟草细胞的亚细胞定位研究进展在过去的几十年中，人们对烟草细胞的亚细胞定位进行了广泛的研究。
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本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时
8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 5.7 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：
推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。