农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草农杆菌转化实验实验配方：1LRMOP: 20×大量元素50ml200×微量元素5ml200×有机5ml200×铁盐5ml3%蔗糖30g0.8%琼脂（国产）4g/500ml灭菌后，每500ml培养基加入:0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μLYEB:液体培养基：1L酵母提取物1g牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4•7H2O 0.5gpH7.0 高压灭菌。
固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。
二．质粒DNA导入农杆菌①电转法：1.取农杆菌感受态在冰上冻融；2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌侵染烟草原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种常见的细菌，它引起了许多植物疾病，并广泛应用于植物基因转化和构建转基因植物。
农杆菌感染的方式分为两个主要步骤：附着和转化。
首先，农杆菌通过其特殊的附着鞭毛附着在植物细胞的表面。
这些附着鞭毛具有与植物表面组织相互作用的能力，帮助菌体在细胞壁上定位。
然后，农杆菌进一步通过组成细菌群体的多聚糖特异性识别植物细胞并贴附在其表面。
这个过程涉及的多聚糖是菌体外表面中的一种多糖物质，称为Beta-1,2-葡聚糖。
该多糖与植物细胞表面的特定受体结合，使细菌固定在植物细胞表面。
接下来，农杆菌通过化学信号释放细菌表面小分子信号物质，称为诱导物质。
这些诱导物质与植物细胞的感受器相互作用，诱导植物细胞启动反响。
在感染过程中，农杆菌释放的Ti质粒在接触植物表面后激活，融入植物细胞胞质。
这个过程主要涉及到Ti质粒上的一些基因区域，称为过渡区，它负责将外源基因转移到植物细胞中。
接下来，T DNA被运送到植物细胞的细胞核中。
T DNA的传输过程主要受T基因（vir基因）的操控，这些基因编码用于T DNA传输的蛋白质。
一旦T DNA被引入细胞核，它会被整合到植物细胞的基因组中，并在细胞分裂过程中通过传代进行稳定遗传。
这个过程涉及到转座酶（T nase）等蛋白质的参与，它们帮助将T DNA插入植物基因组的特定区域。
总之，农杆菌侵染烟草的原理涉及一系列复杂的分子交互作用和基因调控过程。
通过附着、感染、引入TDNA以及其整合到植物基因组中，农杆菌成功地将外源基因引入烟草细胞，并构建转基因烟草。
这为基因工程研究和转基因植物生产提供了重要的工具和方法。
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化是一种常用的基因转移技术，可以将外源DNA导入植物细胞。
下面是农杆菌转化实验的基本步骤：
1. 制备农杆菌：首先，选择适合的农杆菌株，常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens。
接种农杆菌于适宜的培养基中，培养至合适的生长期。
2. 构建质粒：在进行转化实验前，需要构建包含目标基因的质粒。
质粒可以通过常规的分子生物学技术，如PCR扩增、限制性酶切和连接等方法来获得。
3. 准备细菌：将构建好的质粒转化到农杆菌中。
通常采用电穿孔或热激方法，使质粒能够进入农杆菌内。
4. 感染植物：选择适当的植物愈伤组织或幼苗作为接受体，将其暴露在含有农杆菌的培养基中。
农杆菌会侵入植物细胞，并将质粒转移
到植物基因组中。
5. 抗生素筛选：转化后的细菌通常在培养基中含有特定抗生素。
将被转化的植物细胞接种于含有抗生素的选择培养基中，该抗生素能够选择出已转化的细胞。
只有具备目标基因的细胞能够生长并形成抗性。
6. 再生植物：选定抗生素抗性的植物细胞，进一步培养和处理以促进其发育和增殖。
通过激素处理和适当的培养条件，可以使其分化成完整的植株。
7. 验证转化：最后，通过分子生物学技术，如PCR和Southern blot 分析，来确认转化的植物是否成功地获得了外源基因，以及其在植物细胞中的表达。
农杆菌转化实验是一种常用且有效的方法，可用于植物基因工程及改良研究。
通过以上步骤，可以成功将目标基因导入植物细胞中，以获得具有所需性状的转基因植物。
农杆菌注射烟草转化
农杆菌注射烟草实验步骤
农杆菌转化
1. 取1µl 质粒加入50µl 刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB 培养液，1.5ml 灭菌管，电击杯，移液枪，枪尖等）。
★感受态易失效，准备工作须充分
2. 吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡），放入电击仪（调manal 至1.6-1.7）。
3. 电击完立即加入1mlLB 培养基，混匀，并吸至新的离心管中。
4. 28℃，摇2h （过程中可以准备抗性板子，或提前准备）。
5. 涂板，（使用kan+rif 双抗板）28℃培养36h 。
6. 可做菌落PCR 检测是否转化成功，同时做菌种保藏（根据实验需要）。
接菌注射
1. 挑菌转接
3ml 双抗培养基，27℃摇菌过夜。
★玻璃试管摇菌效果要好些
2. 取20µl 菌液到20 mlLB 培养基中，（20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS +500µlkana/L ）摇菌过夜至OD 值为1.0-1.5。
●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。
3. 3560r/min ,10min 弃上清。
4. 配缓冲液MMA （H 2O+MES 10ml +MgCl 2 10ml +AS 1ml ）,现配现用。
用等量缓冲液重悬菌液。
一份等量，一份少量
5. 调菌液OD 值至1.0，室温放置1h 。
将需要混合的菌液等体积混合，可注射。
实验十八(1)农杆菌感染烟草叶片与共培养
4、 W5稀释液：125mmol/L CaCl2，155mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，5mmol/L葡萄糖，pH5.6。 各组（4人）50ml 5、其他需要高压灭菌的用具同本实验。
其他需要高压灭菌的用具：
过滤器（2），注射筒（1），不锈钢网筛 （=54m）（1），漏斗（1），三角瓶（5）， 滴管（10支），10ml刻度离心管（2支）。
四、步骤
1、农杆菌培养
（1）取新鲜菌落（液）于2ml YEB培养 基（含50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan） 中，28 ℃下，180rpm震荡培养过夜。
（2）将2ml菌液转入20ml培养基（含50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan）中，培养5~6 小时左右。
（3）菌液达到OD600＝0.2～0.5时用于转化。
2、感染
（1）取烟草幼叶，表面消毒（方法同上次实 验），剪切成0.5~1.0cm-2大小。 （2）将叶片放入菌液中，在80r/min摇床上旋 转浸染5～10分钟。
3、共培养
（1）将叶片置于无菌滤纸上吸去多余的菌液。
（2）接种在MS培养基上（0.02mg／L NAA＋ 0.2mg／L BA），在25~28℃黑暗条件下共培 养2~3天。每组接种20瓶。
（2）每3天更换一次培养基。培养条件同前。
下次实验准备（均高压灭菌）
1、CPW培养基+0.4mol/L甘露醇，pH 5.4，各组 （4人）60ml，分装成10ml、10ml和20ml、20ml。 2、20％PEG600，0.06mol/L CaCl2，0.3mol/L甘 露醇。各组（4人）20ml 3、1mol/L 甘氨酸-NaOH，pH10.0 。各组（4人） 10ml。
[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法
![[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法](https://img.taocdn.com/s3/m/e8c47eb56f1aff00bfd51e41.png)
[植物科学领域]利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法Method for transient expression in vivo by infecting tobacco with Agrobacterium一、原理（Principle）烟草叶片的瞬时表达系统常用来进行基因的亚细胞定位监测，监测蛋白在细胞中分布的位置，从而对其功能进行预测。
通过基因翻译的蛋白与绿色荧光蛋白构成融合蛋白，在激光共聚焦仪器下观测绿色荧光的分布，判断蛋白表达的部位。
同时，还可根据荧光的光强度检测蛋白的表达量。
该过程是经根癌农杆菌介导的，进而将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
Tobacco leaf transient expression systems are often used to monitor the subcellular localization of genes, monitor the distribution of proteins in cells, and predict their function. The gene translated protein and green fluorescent protein constitute a fusion protein. The distribution of green fluorescence is observed under a laser confocal instrument to determine the protein expression site. At the same time, the expression level of the protein can also be detected based on the light intensity of the fluorescence. This process is mediated by Agrobacterium tumefaciens, which integrates the gene of interest into tobacco cells.二、材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. MES: 2-(N-吗啉代)乙磺酸6. 抗生素7. 注射器Materials and reagents1. Agrobacterium strain carrying an expression vector (usually the expression vector is driven by the 35S promoter)2. Tobacco plants for 2-4 weeks3.LB medium4.Acetosyringone5.MES: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid6.Antibiotics7. syringe三、仪器1. 50 ml 离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜Third, the instrument1. 50 ml centrifuge tube2. spectrometer3. UV lamp4. fluorescence microscope四、步骤1. 挑取单克隆于5 ml LB液体培养中，28~30°C震荡培养。
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌侵染烟草原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种特殊的细菌，它能够侵染许多植物，将其基因组改变为自己的目的基因组，导致植物产生肿瘤和其他异常表型。
这种现象被称为植物农杆菌病（Agrobacterium tumefaciens），这种病在园艺学中非常重要，因为它是研究植物基因工程的基石之一。
在农杆菌侵染烟草的过程中，第一步是农杆菌识别和攀附植物细胞。
这是由于农杆菌的一个称为T介导的转移蛋白，该蛋白帮助农杆菌在植物细胞表面形成一个特殊的结构，称为T长度发生器（T-pilus）。
这个结构能够锚定农杆菌在植物表面并促进接触和进一步的识别。
接下来，农杆菌产生特殊的类EB（virulence）素，它是一种特殊的分子信使，这种信使能够刺激植物细胞对农杆菌的进一步感知。
类EB素结合到细胞表面的接收器上，这是植物生长激素的一个重要接受者。
一旦类EB素与植物细胞膜上的接受器结合，它会导致激活一系列的蛋白酶和磷酸酶，这些蛋白酶和磷酸酶控制细胞基因表达和突变。
类EB素还有能力诱导细胞分裂和增殖，这是导致肿瘤形成的关键步骤。
农杆菌还会在细胞表面释放和合成许多其它信使，例如放屈酸等酚酸类化合物。
当植物细胞对类EB素信号的响应被激活后，农杆菌便通过它的第二种转移蛋白，称为T-DNA转移蛋白，将它的DNA片段传入植物细胞中。
T-DNA片段是农杆菌基因组中的一个片段，包含一些促进肿瘤形成或生物合成其它类型激素的基因，也可以包含一些抗生素或草甘膦抗性基因。
这个T-DNA片段被农杆菌员工特殊的切割酶切割成几个区域，第一个区域包含向植物细胞转座所需要的转座酶和反转座酶基因，另外一个区域包含转录的启动子，可以在细胞中启动其它T-DNA区域的基因表达，一个区域包含蛋白合成序列，以及一个主要的T-DNA区域，它编码产生激素，激发植物细胞分裂和生长，产生肿瘤。
同时，农杆菌会生成一个称为细胞外多聚糖（EPS）的多糖复合物，它可以隐藏T-DNA 分子并保护它不被宿主植物细胞发现和破坏。
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。
可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。
二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。
但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。
用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。
为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。
三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。
使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。
2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。
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农杆菌侵染烟草叶片表皮
细胞实验步骤
This manuscript was revised on November 28, 2020
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
整理人：早熟组赵凤利
一、准备试剂：
1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；
2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na
3PO
4
·12H
2
O 原
液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH
2
O至50ml。
1). 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH
2
O，保存于4℃
2). 20 mM Na
3PO
4
·12H
2
O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH
2
O，保存于4℃
3). 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于 -20℃。
二、实验步骤：
1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；
2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；
3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；
4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；
5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD
600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD
600
值；
注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。
6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD
600
为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；
如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。
7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；
8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；
9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；
10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；
11.侵染前，用记号笔标记待转区域；
12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中
13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；
14.将侵染后的烟草放回培养室
15.2-3天后：
1). 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；
2). 启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。
参考文献：Nature Protocols, 2006: 2019-2025.。