烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草遗传转化实验
烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。
实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。
配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。
实验材料：烟草叶片愈伤组织。
实验方法：1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。
打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。
4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。
每次更换新鲜培养基时称取重量。
5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。
6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
烟草遗传转化实验实验目的烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。
本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。
实验原理根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
亚细胞定位之烟草转化方法
本氏烟草N. benthamian瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌;2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜;估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率;3、当菌液OD值介于~之间时,1000g,5min离心收集农杆菌;4、用2ml Induction medium without AS轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液;5、重复步骤4;6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬;7、室温放置1~4小时8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液组合详见下文;9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中;使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染;B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 10mMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装避免反复冻融,-20℃;用高压灭菌的超纯水稀释;C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达;严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过;D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在~之间;过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎;。
农杆菌注射烟草转化.
农杆菌注射烟草实验步骤
农杆菌转化
1. 取1µl质粒加入50µl刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB培养液，
1.5ml灭菌管，电击杯，移液枪，枪尖等）。
★感受态易失效，准备工作须充分
2. 吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡），放入电击仪（调manal至1.6-
1.7）。
3. 电击完立即加入1mlLB培养基，混匀，并吸至新的离心管中。
4. 28℃，摇2h（过程中可以准备抗性板子，或提前准备）。
5. 涂板，（使用kan+rif双抗板）28℃培养36h。
6. 可做菌落PCR检测是否转化成功，同时做菌种保藏（根据实验需要）。
接菌注射
1. 挑菌转接3ml
双抗培养基，27℃摇菌过夜。
★玻璃试管摇菌效果要好些
2. 取20µl菌液到20 mlLB培养基中，（20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS +500µlkana/L）摇菌过夜至OD值为1.0-1.5。
●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。
3. 3560r/min ,10min 弃上清。
4. 配缓冲液MMA（H2O+MES 10ml +MgCl2 10ml +AS 1ml）,现配现用。
用等量缓冲液重悬菌液。
一份等量，一份少量
5. 调菌液OD值至1.0，室温放置1h。
将需要混合的菌液等体积混合，可注射。
叶盘法转基因烟草技术
叶盘法转基因烟草技术实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。
农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。
这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。
三. 试剂及设备1.试剂：MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cb：羧苄青霉素NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/LT3培养基：MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L（T2：生长培养基；T3：生根培养基）2.仪器：光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1 农杆菌培养1）从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上27℃，180 rpm 摇培过夜至OD 600 为0.6-0.8。
2）摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB 培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右，OD600 为0.2-0.5 时即可用于转化。
或：将按上述方法培养的OD 600 为0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000 rpm 离心10 min，去掉上清液，菌体用1/2 MS液体（pH 5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600 为0.2 左右，用于转化。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
农杆菌介导的烟草转化
准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)
1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）
Kan,Rif / Basta,Rif
1.根癌农杆菌的活化
挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50μ g/ml和Kan 50-100μg/ml）中，28℃-30℃200rpm 振荡培养过夜。
2.农杆菌介导叶盘法转化植物
①农杆菌菌体处理
挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50μg/ml和kan50μg/ml），200rpm，28℃培养24h，菌液OD600至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。
再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为0.3-0.5。
②叶盘法转化转化植物程序
选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染3-5min，置于无菌吸水纸吸干，平铺于SIM （MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta 5mg/L+500μg/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。
待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50μg/ml+500μg/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。
Cb: 羧卞青霉素; Cef:头孢霉素。
烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草农杆菌转化实验实验配方：1LRMOP: 20×大量元素50ml200×微量元素5ml200×有机5ml200×铁盐5ml3%蔗糖30g0.8%琼脂（国产）4g/500ml灭菌后，每500ml培养基加入:0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μLYEB:液体培养基：1L酵母提取物1g牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4•7H2O 0.5gpH7.0 高压灭菌。
固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。
二．质粒DNA导入农杆菌①电转法：1.取农杆菌感受态在冰上冻融；2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。
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烟草农杆菌转化实验
实验配方：1L
RMOP: 20×大量元素50ml
200×微量元素5ml
200×有机5ml
200×铁盐5ml
3%蔗糖30g
0.8%琼脂（国产）4g/500ml
灭菌后，每500ml培养基加入:
0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL
1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μL
YEB:
液体培养基：1L
酵母提取物1g
牛肉膏5g
蛋白胨5g
蔗糖5g
MgSO4•7H2O 0.5g
pH7.0 高压灭菌。
固体培养基：
每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml
利福平（Rif）储液：50mg/ml
YEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备
（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；
（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；
（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；
（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；
（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。
二．质粒DNA导入农杆菌
①电转法：
1.取农杆菌感受态在冰上冻融；
2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；
3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；
4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；
5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；
6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。
②冻融法：
1、在200µl感受态细胞中加入2－6µl质粒DNA，冰浴5min，液氮中速冻5min；
2、迅速转入37℃水浴中，热激5min；
3、加入1ml YEB（不含抗生素）液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4小时；
4、3000rpm离心4min，去一部分上清，留取200µl菌液涂布于含有50mg/l Kan 和50mg/l Rif的YEB平板；
5、放置约0.5h，待水份干后，28℃培养约24小时至长出菌落。
6、挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。
三．烟草遗传转化实验
①准备农杆菌
（1）将农杆菌在平板上划线，从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素（kan 50mg/L, Rif 50mg/L）的YEB液体培养基中，在恒温摇床上，于28℃下以180r/min培养至OD600为0.6~0.8（约需17h）。
（2）将OD600为0.6~0.8的菌液，按1%~2%的比例，转入新配制的无抗生素（含Rif）的YEB液体培养基中，可同时加入100~500µmol/L的乙酰丁香酮。
在上述相同的条件下再培养6h左右，待OD600为0.2~0.5时即可用于转化。
②侵染烟草实验
（1）4℃，2500r/min 离心沉淀菌体，在超净工作台上，用40ml MS重悬，将重悬好的菌液倒入玻璃平板中，将切成5×5mm大小的烟草叶片（萌发一个月左右的烟草）放入菌液中，浸泡5-30min（通常10min左右），取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
（2）将浸染过的叶片放在RMOP上，在28℃暗培养条件下共培养2-4天（3天即可）。
（3）将经过共培养的外植体移到加有抗生素（100mg/L kana ）的RMOP（附加500mg/L的羧苄青霉素，抑制农标菌生长）上，在光照为25 μmol•m-2▪s-1、25℃条件下进行选择培养。
（4）选择培养2－3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基（RMOP+100mg/L kana+500mg/L Cb）中进行继代培养。
（5）待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的烟草生根培养基（MS+0.1mg/L NAA+100mg/L kana+500mg/L Cb）上进行生根培养，两周左右长出不定根，稍长大后可做分子鉴定。