植物表达载体转化农杆菌操作步骤
根瘤农杆菌介导植物转基因流程
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农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，它利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这一技术在农业、园艺和生物学研究领域有着广泛的应用，其原理和操作流程值得我们深入了解和掌握。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个步骤，识别、转移DNA、整合DNA和表达DNA。
首先，农杆菌通过感知植物产生的信号物质识别寄主细胞，然后将其T-DNA（转移DNA）片段转移到植物细胞内。
T-DNA片段携带了外源基因和一些调控基因，一旦被转移到植物细胞内，这些基因就会被整合到植物基因组中。
最后，这些外源基因就会在植物细胞内表达，从而产生相应的表型变化。
在实际操作中，农杆菌转化法需要进行一系列的步骤。
首先，要选择适合的农杆菌菌株，并将目标基因插入到适当的植物转化载体中。
然后，将植物组织暴露在含有农杆菌的培养基中，使农杆菌能够侵染到植物细胞内。
接下来，将植物组织转移到含有适当激素和抗生素的培养基中，促使转化的植物细胞再生成整株植物。
最后，对转化后的植物进行筛选和鉴定，确保外源基因的稳定整合和表达。
农杆菌转化法的优点在于其操作简单、适用范围广泛、转化效率高和转化植物种类多样。
同时，它也存在一些局限性，比如对植物种类的依赖性强、转化后植物的表达水平不稳定等。
因此，在实际应用中需要根据具体情况选择合适的转化方法。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，为我们研究植物基因功能、改良农作物品质和培育新品种提供了重要的手段。
通过深入了解其原理和操作流程，我们可以更好地掌握这一技术，为农业生产和科学研究提供更多可能性。
植物抗体制备
植物抗体制备
植物抗体制备是一种生物技术方法，用于从植物中收集和纯化特定目标蛋白的抗体。
下面是一种常见的植物抗体制备方法：
1. 选择表达载体：选择适合在植物中表达目标蛋白的表达载体，并将目标蛋白的编码序列插入该载体中。
2. 转化植物细胞：将表达载体导入植物细胞中，可以通过基因枪法、农杆菌介导法等方法进行。
3. 筛选转化植株：通过对转化植株进行筛选，例如利用抗生素选择性培养基，筛选出携带目标蛋白表达载体的转化植株。
4. 扩大培养：将筛选得到的转化植株进行扩大培养，使其生长成成熟植株。
5. 收获植物材料：收获植物材料，包括根、茎、叶等组织，用于提取目标蛋白。
6. 蛋白提取：利用蛋白提取缓冲液等方法，将目标蛋白从植物材料中提取出来。
7. 抗体纯化：利用亲和层析、凝胶过滤、电泳等方法，对提取的目标蛋白进行纯化，得到纯化的目标蛋白。
8. 免疫原制备：将纯化的目标蛋白用于免疫动物（如小鼠）以制备抗体。
9. 抗体收集：从免疫动物中收集得到的抗体，可以通过抗体纯化和浓缩等步骤进行进一步纯化和处理。
10. 抗体检测：利用收集到的抗体，可以进行免疫组化、免疫印迹、ELISA等方法对目标蛋白进行定量和定位分析。
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或 Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600=0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素农杆菌介导植物转化是一种常用的基因转化技术，利用农杆菌转化DNA进入植物细胞，使其表达目的基因。
在这个过程中，农杆菌的外源DNA会被单胞菌分泌物（Vir）基因编码的蛋白质工具分子T-DNA结合酶（VirD2）切割成目标T-DNA片段，然后T-DNA和Vir蛋白质工具分子挤进被切开的植物细胞，最终整合入植物细胞的染色体中。
1.农杆菌菌株：农杆菌菌株的选择对转化效率有重要影响。
通常选择具有较高转化效率的农杆菌菌株，如LBA4404、GV3101等。
不同的菌株对于不同的植物种类和品种可能有不同的适应性，因此需要根据具体情况进行选择。
2.感受性植物：不同植物对农杆菌介导植物转化的感受性各不相同，高度感受性的植物容易进行转化。
除了感受性外，植物的再生能力也是影响转化效率的因素之一、通常来说，拥有较高再生能力的植物对转化更加容易。
3.T-DNA载体：T-DNA载体是构建农杆菌介导植物转化载体的关键。
在农杆菌介导植物转化过程中，目标基因的载体必须经过农杆菌系统与植物细胞进行相应的介导，进而整合到植物细胞基因组中。
选择合适的T-DNA载体进行构建，可以提高转化效率。
此外，T-DNA载体中导入基因的拷贝数、插入位点的选择等也会对转化效率产生影响。
4.辅助物质：除了基础的转化体系以外，辅助物质也是影响转化效率的一个重要因素。
辅助物质主要包括感受性缓解物质、抗生素等。
感受性缓解物质主要用于保护不同类型的植物细胞免受农杆菌侵染造成的伤害，提高细胞存活率；抗生素主要用于抑制农杆菌菌落的生长，避免菌落过度生长对植物细胞的负面影响。
辅助物质的添加可以有效增加转化效率。
5.转化条件：转化温度、菌液浓度、转化时间等转化条件也会对转化效率产生影响。
具体条件需要根据植物种类和品种的特点进行优化。
总之，农杆菌介导植物转化主要是通过农杆菌菌株和植物的相互作用引发变化，其转化效率受多个因素的综合影响。
农杆菌转化法及转基因植物检测方法
农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。
植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。
另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。
本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。
关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。
1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。
随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。
新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。
植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。
使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。
同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。
目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。
本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。
1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。
能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。
转基因的方法和原理（可编辑）
转基因的方法和原理转基因的方法和原理 1目的基因制备和载体系统 2几种有效的转基因方法 3定点突变和受体系统简介转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。
转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。
转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。
基本步骤 1.分离获得目的基因； 2.在体外进行DNA重组，将外源DNA 连接到能自我复制又带有选择标记的载体上； 3.将重组DNA转移入受体细胞；4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；目的基因制备和载体系统目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。
载体：质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等 PCR反应 PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。
PCR要求反应体系具有以下条件： 1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物约20个碱基左右； 2、具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶； 3、4种dNTP； 4、作为模板的目的DNA序列。
PCR反应可扩增出100～5000bp的目的基因。
PCR反应过程 1、变性，即将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；2、退火，将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对；3、延伸，将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。
反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。
利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有poly A这一结构特点，可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子，根据碱基配对原则，将其吸附，从真核细胞的总RNA中提取出来，再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前，首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象，而目标基因则是具有特定功能的基因，如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介，通常由DNA序列构成。
在构建载体时，需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并加入其他必要的DNA片段，如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中，然后利用农杆菌侵染植物组织，将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后，需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株，常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性，在培养基中添加相应抗生素或除草剂后，只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后，需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长，以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后，需要对其进行鉴定，确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法，可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功，就可以进行后续的分子生物学和生理学分析，如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外，转化植株也可以用于基因工程和农业生产中，如改良作物品质、提高产量等。
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植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源：郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
3）质粒酶切或PCR鉴定。
6、三亲交配法：参考一：1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP；pK载体：50μg"ml -1Kan；pTCK载体：50μg"ml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养；3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μg"mL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养；4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜；6）挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落；（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str）8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。
10）将阳性单菌落再次划线纯化。
三亲交配法：参考二：1)从保存根癌农杆菌LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于10m1不含抗生素的LB液体培养基中，28℃, 200rpm培养24h;2)从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养约8h;3)从保存辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃, 250rpm培养约8h;4)分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于无抗生素的LB平板上，28℃培养过夜;5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kan 50ug/ml,Str 25ug/ml和Rif 25ug/ml的LB平板上，28℃培养过夜;同时各取1, 2, 3步骤中的菌液100u}分别涂布于含有三种抗生素的LB平板上，作为对照。
注意一、农杆菌提取质粒，拷贝数较低，很难用酶切鉴定的方法鉴别。
因此一般用PCR鉴定。
（PCR鉴定时要做好阴性对照。
一般以未带有目的基因的空载体和未经转化的空农杆菌做对照）。
另外，未完善起见，可做回转化：即将农杆菌中提取的质粒电泳和PCR鉴定后，再将其回转到大肠杆菌中，再提取质粒酶切鉴定。
注意二、LBA4404为利福平和链霉素抗性，EHA105为利福平抗性，pRK2013为Kan抗性注意三、1）、利福平，溶于甲醇或氢氧化钠溶解后无菌蒸馏水定容，贮液20mg/ml，-20保存三个月，使用浓度50~100L。
2）、利福平(Rif)先用少量无水乙醇溶解，最后用无菌水配成50mg/ml的母液，过滤灭菌。
3）、利福平用甲醇配成浓度为20mg/ml，于－20度保存。
工作浓度50ug/ml4）、链霉素用水融解至浓度为10 mg/ml后于－20度保存。
工作浓度50ug/ml5）、溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
抗生素储存液工作浓度浓度(mg/ml) 保存条件严紧型质粒(μg/ml) 松弛型质粒(μg/ml)氨苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60羧苄青霉素 50 (溶于水) -20℃ 20 60氯霉素 34 (溶于乙醇) -20℃ 25 170卡那霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50链霉素 10 (溶于水) -20℃ 10 50四环素 5 (溶于乙醇) -20℃ 10 507、水稻胚性愈伤组织的诱导取授粉后10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮，于70%酒精浸泡3min（或75％酒精浸泡1min），再于0.1%升汞中浸泡15min（或再转入20％的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌25min），超净工作台中无菌水清洗3-5次，将消毒后种子的幼胚用镊子挤出，接种于诱导培养基上，每个皿约放35粒，28℃暗培养4－5d，切除胚根，继续培养12-15d，待愈伤长大后进行继代培养，每两周继代一次，共继代2-3次；成熟胚去壳，用镊子将有胚的一半切下，经上述方法消毒后，置于诱导培养基上。
28℃暗培养至长出愈伤组织。
选用培养或预培养4天的愈伤组织作为转化材料。
（第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农杆菌转化）8、根癌农杆菌的培养平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中（pEmu载体：50μg"ml -1AMP＋50μg"mL-1 Rif/Str；pK载体：50μg"ml -1Kan＋50μg"mL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μg"ml -1Kan ＋50μg"mL-1 Rif/Str），28℃摇床过夜，再按1%接种量转接入50mL同样培养基中（含相应抗生素）培养8小时左右至OD600为0.5左右。
4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。
然后用5mL含100 uM AS的AAM液体培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50mL的含100uM AS的AAM液培中，28℃摇床上培养至OD600=0.5。
9、愈伤组织的预培养取生长旺盛的胚性愈伤组织（从继代培养上挑选分散状，颜色鲜黄的2－3mm的胚性愈伤颗粒）转接到预培养培养基，27℃暗培养3－4天。
生长旺盛的愈伤用于农杆菌转化。
10、愈伤组织与根癌农杆菌的共培养取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织（预培养4d的水稻幼胚去掉胚芽或继代2-3周后2-3mm的愈伤颗粒转入新鲜培养基中预培养4d），置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液（含100uM AS）中10-15min后将幼胚取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并凉干，随即转移到共培养培养基上，于28℃（或25℃）暗培养2－3天。
11、洗除农杆菌共培养2－3天后，即农杆菌生长至可见愈伤下有少量菌斑时，挑取共培养的愈伤置于无菌三角瓶中，用（含有250mg"L-1羧苄青霉素的）无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。
最后一次清洗时静止1小时，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。
最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水，静止30－50min，期间振荡几次，倒掉液体，置愈伤于无菌滤纸上凉干，然后转移到筛选培养基上，置25℃培养箱内暗培养。
11、抗性愈伤的筛选将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，每两周转接1次。
培养4－8周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。
挑选这些抗性愈伤继续在选择培养基上暗培养2次，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。
（并转入筛选培养基N6-S1中，进行选择培养。
两周后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织，转到N6-S2筛选培养基上继续筛选2-3代，2周/代）。
（N6 -S1：N6，100mg"L-1G418，250mg"L-1羧苄青霉素）（N6 -S2：N6，50mg"L-1G418，125mg"L-1羧苄青霉素）12、抗性愈伤的分化培养经抗生素筛选长出的抗性愈伤，PCR初步鉴定后，转入分化培养基中继续培养，26℃暗培养1周，然后转入25℃光照培养（12h光照，12h黑暗）。
13、转基因植株的再生及幼苗移栽转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。
（筛选4周后，选择生长旺盛，色泽淡黄的抗性愈伤组织，转移到分化培养基进行分化出苗，光照24h/d，再生的小苗长至2-3cm左右时）将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待苗高7~10cm时，打开瓶盖于温室中炼苗5~7天，待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净跟上的培养基，移至温室盆栽（铁盘中）。