第四章植物遗传转化技术
植物遗传转化技术
binary vector
• 包括mini-Ti质粒（T-DNA边界，缺失Vir区）和 helper Ti质粒（含有Vir区缺失T-DNA边界，相当 于co-integrated vector 的disarmed Ti质粒） mini-Ti质粒：pBin19，pCAMBIA系列 helper Ti质粒：EHA105，LBA4404（pAL4404）
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Co-integration plasmid
• 一元载体系统A plasmid based on pBR322 used to clone gene of interest
• A Ti-based vector: pGV3850 (LB, RB, most of T-DNA replaced by pBR322)
Left border
Right border
12-24 kbp
vir genes
Opine
ori
catabolism
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3. 创伤诱导分子
• 是一类可溶性的小分子酚类化合物 • 乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、羟
基乙酰丁香酮（acetosyringone，OH-AS） • A.t: recognition and chemotaxis （趋化性）
• Left and right border (LB\RB):TDNA左右两侧各有一段25bp的重复 序列，在T-DNA的整合中起重要作用
• Ori区(origin of replication)：该区段 基因调控Ti质粒的自我复制，故称之 为复制起始区。
T-DNA region
Auxin Cytokinin Opine
• T-DNA和vir基因参与，T-DNA上的基因与 T-DNA的转移及整合有关，因为它不编码 T-DNA转移的产物。
植物次生代谢产物的遗传转化及其应用研究
植物次生代谢产物的遗传转化及其应用研究植物次生代谢产物是指在植物体内不参与基本生命活动，但在植物生长发育、适应环境和与外界的相互作用中发挥重要作用的化合物。
这些化合物的种类繁多，包括单萜、生物碱、黄酮类、苯丙素类等。
它们不仅对植物自身有重要生理功能，而且对人类和动物也具有重要药用、食用和工业用途。
植物次生代谢产物的遗传转化是指通过遗传工程手段，将植物细胞中的代谢途径重定向到制备某种次生代谢产物上。
通过转化后的植物，可在量上和质上有所改变，使之适应更广泛的应用。
近年来，植物次生代谢产物的遗传转化技术已经得到广泛的研究和应用。
一、植物次生代谢产物的遗传转化方法1、基因克隆基因克隆是遗传转化的基础。
植物次生代谢产物的代谢途径复杂，往往涉及多个基因的调控和协同。
因此，精准地克隆和分离涉及到的基因，是植物次生代谢产物的遗传转化研究的重要前提。
2、遗传转化技术遗传转化技术是指将外源基因（如酵母、细菌、动物等）导入植物，使其在植物体内表达。
常用的植物遗传转化技术有农杆菌介导遗传转化、微粒轰击法、基因炮法等。
通过遗传转化技术，可以在植物中导入指定的基因，构建其次生代谢产物合成途径。
3、分子改造分子改造是指利用现代分子生物学技术，对已知基因进行修改以达到人为控制次生代谢物质规模的目的。
常用的分子改造技术有基因沉默、基因敲除、反义基因等。
二、植物次生代谢产物的遗传转化应用研究1、药物应用植物次生代谢产物是开发药物的重要来源之一。
利用遗传转化技术，可以大量生产与已知药物相似的次生代谢产物，用于药物筛选和研发过程中的临床扩展。
近年来，通过植物遗传转化的方式生产的药物已经接近商业生产阶段，其中最为成功的是肺癌药物紫杉醇。
2、食品应用植物次生代谢产物还可以应用于食品领域。
通过遗传转化技术，植物可以生产出与已知食品相似的次生代谢产物，获得更佳的口感和口味。
此外，植物次生代谢产物还可以增强食物的营养价值，如增加维生素、蛋白质等。
遗传转化技术
遗传转化技术遗传转化技术（Genetic transformation）是一种将外源DNA导入目标细胞以改变其遗传性状的生物技术。
通过遗传转化技术，科学家可以将特定基因导入目标生物体，从而使其表达具有特定功能的蛋白质或产生特定的代谢产物。
这项技术在农业、医学和生物学研究领域都有重要的应用，可以帮助改良农作物、生产药物和研究基因功能等。
本文将从遗传转化技术的原理、方法、应用和未来发展等几个方面进行详细介绍。
一、遗传转化技术的原理遗传转化技术的原理是通过将外源DNA导入目标细胞，使其在目标细胞中稳定表达而产生特定的遗传性状。
这一过程包括DNA的导入、整合和表达等步骤，下面将分别介绍这些步骤。
1. DNA的导入DNA的导入是遗传转化的第一步，有多种方法可实现DNA的导入，包括化学转化、生物弹道法、冷冻转化法等。
其中，最常用的方法是利用冷冻转化法和冷冻方式使DNA导入目标细胞。
此外，也可以利用质粒、病毒和细菌等载体将DNA导入目标细胞。
2. DNA的整合DNA的整合是指外源DNA在目标细胞中的稳定整合，以确保其可以稳定地在细胞中传递和复制。
整合是遗传转化的关键步骤，其研究是提高转化效率和稳定性的重要途径。
3. DNA的表达DNA的表达是指外源DNA在目标细胞中被转录和翻译，最终产生特定的蛋白质或代谢产物。
DNA的表达与其整合程度、基因调控、转录水平等因素有关，对DNA的表达进行调控是提高遗传转化效率和稳定性的重要手段。
二、遗传转化技术的方法在遗传转化技术中，有多种方法可以将外源DNA导入目标细胞，并实现其稳定表达。
这些方法包括冷冻转化法、生物弹道法、基因枪法、质粒介导和病毒介导等，下面将对这些方法进行详细介绍。
1.冷冻转化法冷冻转化法是通过使目标细胞在低温条件下，先后进行冷冻和解冻，并向其注入DNA，利用渗透剂和真核细胞基因组重复生成的能力，使外源DNA稳定地整合到目标细胞的方法。
该方法简单、操作方便，适用于多种生物体。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤
植物遗传转化是指通过人为手段，将外来基因导入植物细胞内，使其产生新的遗传特征。
植物遗传转化的步骤主要包括以下几个方面： 1. 基因载体构建：基因载体是将所需基因导入植物细胞内的载体，包括质粒、病毒、人工染色体等。
构建基因载体需要选择适当的载体和适合的启动子、终止子、选择标记等元件。
2. 转化体系建立：植物遗传转化需要建立一套合适的转化体系，包括培养基的配制、细胞培养和再生体系等。
转化体系的搭建需要考虑到不同物种、基因载体和转化方法的特点。
3. 基因导入：基因导入可以通过直接基因转移、基因炮击、农
杆菌介导转化等手段进行。
其中，农杆菌介导转化是最常用的基因导入方法。
在基因导入过程中，可以使用选择标记来筛选生产基因转化植株。
4. 识别和筛选：基因转化后的植物细胞需要进行识别和筛选。
常用的识别方法包括PCR检测、Southern杂交、Northern杂交等。
筛选方法可以通过细菌耐草酸和遗传标记等手段进行。
5. 品系选育：经过基因转化的植物需要进行品系选育，通过选
择有利的基因型和表型，后代将具有更好的遗传特征。
品系选育需要进行多代重复筛选，最终得到具有稳定表达和优良性状的转化植株。
6. 安全评价：基因转化后的植物需要进行安全评价，包括对植
物生长性状、代谢产物、土壤微生物等方面的评价。
安全评价是确保基因转化植物的生态安全性和食品安全性的重要环节。
转基因育种技术优秀课件
常用的受体材料有以下几大类型: 1.愈伤组织再生系统
外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化（带有目 的基因质粒的农杆菌侵染），分化培养获得再生植株。
优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因， 转化效率高。 缺点：遗传稳定性差、嵌合体，因此需要连续的再生系统
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2.直接分化再生系统
外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直 接分化出不定芽形成再生植株。
转基因育种技术优秀课件
第一节 转基因育种的概念
一、植物遗传转化（植物基因工程）
以植物为对象，采用重组DNA 技术将外源目的基因导入受体植物基因 组，最后获得外源目的基因正确表达和稳 定遗传的新植物类型。
核心技术是重组DNA技术
重组DNA（recombinant DNA）：是指人工创造的自然界
中不存在的DNA分子。主要指利用不同生物来源的DNA分子拼
以病毒载体和质粒载体介导的遗传转化比较多。
五、Ti质
粒 有一种土壤细菌,称为农 杆菌，它能诱导植物伤口形成冠瘿瘤， 细菌的致瘤能力来源于细菌内的一个 额外染色体即质粒(plasmid)，称Ti质 粒。
优点：生殖细胞不仅具有全能性，而且接受外源遗传 物质的能力强，导入外源基因成功率高，更易 获得转基因植株。又因生殖细胞是单细胞，转 化的基因五显隐性影响，外源目的基因充分表 达。因此利用生殖细胞作为转基因受体与单倍 体育种技术相结合，可简化和缩短育种纯化过 程。
缺点：获得单细胞只能在开花期，常受到季节及生长 条件的限制。
色体组中，并再
良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 1、必须具有脱分化和再生能力，能够形成新的植物体。高
效稳定的再生能力； 2、受体材料要有较高的遗传稳定性； 3、外植体来源方便，如胚和其它器官等； 4、对筛选剂敏感； 5、能够接受外源基因，并通过基因重组或其它途径使外源
园艺植物遗传转化
园艺植物遗传转化
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
3，具有稳定的外植体来源 转基因研究的工作效率不高，同一实验内
容往往需要多次重复进行。 只有稳定的外植体来源，才能够方便科学研
究的进行，并从材料的源头上提高实验结果的 重现性，便于对实验结果的总结。
由种子萌发得到的子叶、胚轴；以及无菌培 养的小苗叶片，都是比较理想的材料。
抗病虫育种、抗逆境育种、品质改良
功能基因组学
（functional genomics）
基因加标(gene tagging) 基因敲除(gene knock-out) 候选克隆的功能互补试验
植物代谢工程
( plant metabolic engineering )
利用转特殊基因的植物作为生物反应器 (bioreactor)工厂化生产工业或医药用品
园艺植物遗传转化
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第一节 植物遗传转化的基础
3，植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不 涉及非目标累赘基因，因而更具有针对性，可加快育 种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制， 扩大可利用的资源库（动物、植物、微生物、人工种质；
5，导入外源基因的方法
目前应用最多的是基因枪法和农杆菌介导法 （具体参考实验指导书）
园艺植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
园艺植物遗传转化
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
园艺植物遗传转化
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第二节 转化的受体系统
植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti 质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti 质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
遗传转化的方法和技术
遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。
其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。
其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。
改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。
保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。
在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。
在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。
在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。
2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。
发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。
发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。
例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。
农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。
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Vir基因的功能： 诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上– VirA蛋白； 产物诱导T-DNA形成单股DNA片段--VirD蛋白； 将T-DNA转入植物细胞，整合到寄主基因组中-VirD、E蛋白； T-DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠 瘿碱。
第四章植物遗传转化技术
▪ T-DNA（Transfer DNA） ▪ 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到
第四章植物遗传转化技术
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿 碱种类不同分：
• 章鱼碱型（octopine） • 胭脂碱型（nopaline） • 农杆碱型（agropine） • 琥珀碱型（agrocinoine）
第四章植物遗传转化技术
章鱼碱的遗传图
胭脂碱的遗传图
第四章植物遗传转化技术
Ti质粒结构
植物遗传转化载体
第四章植物遗传转化技术
作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能： 1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去，并且 整合到宿主细胞的基因组DNA上； 2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的 DNA序列。
第四章植物遗传转化技术
农杆菌的Ti质粒
人们很早就发现双子叶 植物常发生一种冠瘿瘤病， 该病在法国、东欧和意大 利的葡萄和果树上曾大面 积发生。
第四章植物遗传转化技术
5 农杆菌介导
几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的 根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一 种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A. tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该 菌细胞内的野生型Ti （Tumor-inducing）质 粒介导的。
第四章植物遗传转化技术
第四章植物遗传转化技术
1 基因枪转化法 将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用 特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力 为430 m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米 籽、叶片等，但进去的DNA片段整合效率极低。
第四章植物遗传转化技术
2 电击法
将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生 质体悬浮液中，混合物在 200-600V/cm 的 电场中处理若干秒，然后将原生质体在组织 培养基中生长，再生出整株植物。
根瘤菌细胞
根瘤菌染色体上的一个
操纵子表达。vir基因产
物将Ti质粒上的T-DNA
单链切下，而根瘤菌染
色体上的操成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中， 从而实现基因的转移。
这一方法是我国科学家周光宇首先提出设 计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大 豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。
第四章植物遗传转化技术
• 花粉管导入法的特点是直接、简便。 • 受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养
的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍， 特别适合于难以建立有效再生系统的植物。 • 由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或 早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。
T-DNA区、毒性区(vir)、质粒复制起点(ori)、质粒 结合转移位点(con)、冠瘿碱分解位点(ocs or nos)
T第i四质章植粒物遗结传转构化技术
生长素合成基因 Onc基因 细胞分裂素合成基因 冠瘿碱合成基因合成基因
左边界LB
右边界RB
Vir基因
Con区
复制起始位点
第四章植物遗传转化技术
第四章 植物遗传转化技术
第四章植物遗传转化技术
植物遗传转化
• 植物遗传转化是指以植物器官、组织、细 胞或原生质体作为受体，通过某种技术或 途径转入外源基因，获得使外源基因稳定 表达的可育植株的过程。
第四章植物遗传转化技术
植物遗传转化方法
第四章植物遗传转化技术
植物遗传转化常用的方法 1、载体法转化——农杆菌介导法（Ti质粒） 2、非载体介导的遗传转化 （1）基因枪法 （2）超声波法 （3）脂质体法（又称融合法） （4）电转化 （5）花粉管转化
1907年首先发现这种冠瘿 瘤病是由根癌农杆菌引发 的。
第四章植物遗传转化技术
电镜下的根癌农杆菌
第四章植物遗传转化技术
冠瘿瘤
1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离 了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于 200kb），称为Ti质粒。
第四章植物遗传转化技术
1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细 胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质 粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。
Vir区（毒性区）：与T-DNA区彼此相邻，约占Ti质粒 总长度的1/3； 该区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗 传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性； Vir区段总长度约35kb，由7个互补群组成； 毒性区中各位点的表达情况分为两种： 组成性表达 植物诱导性表达
第四章植物遗传转化技术
第四章植物遗传转化技术
3 融合法
将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混 合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的 脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选 融合子，再生植物细胞壁。
所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均 存在一个难题，即：原生质体再生出整株植物 比较难。
第四章植物遗传转化技术
4 花粉管导入法 外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形
植物细胞的一段DNA； ▪ T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是
T-DNA的边缘区。 ▪ LB；RB ▪ 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，
单链T-DNA进入植物细胞
第四章植物遗传转化技术
Ti 质粒致瘤的分子机制
损伤的植物根部会分泌 乙酰丁香酸
出乙酰丁香酸和羟基乙
酰丁香酸，它们能诱导 Ti质粒上的vir基因以及
实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中 并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发 现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定 地传给植物的后代。
Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重 要基础。
第四章植物遗传转化技术
第四章植物遗传转化技术
Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质； 双股共价闭合的环状DNA分子； T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表达； 长度150-200KB； 植物基因工程常用的载体。