5.植物外源基因转化方法及转化子的检测
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
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外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
转化子筛选方法
转化子筛选方法所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移,使受体细胞表现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体（transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
一.a互补所谓基因内互补作用，在LacZ体系中，是指二个彼此互补的突变基因(突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β—半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X—gal(5-溴-4-氯—3-吲哚-β—D—半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴—4—氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。
然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后，就会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补，因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。
根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。
此法又称蓝白筛选法。
二.杂交筛选该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。
将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板，它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。
因此，能够进行重复筛选，效率高,可靠性强,而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。
2。
斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来。
2）抽提纯化，蛋白质、杂DNA等减少，所以能得到更为确切的结果，既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。
3。
Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因.三.插入失活根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因转化小实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因转化是分子生物学领域的一个重要技术，它通过将外源基因导入宿主细胞中，使宿主细胞表达外源基因所编码的蛋白质。
基因转化技术在基因工程、生物制药、农业等领域具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究基因转化技术在微生物中的可行性，以期为后续研究提供参考。
二、实验目的1. 了解基因转化技术的基本原理和操作步骤；2. 掌握基因转化实验的操作方法；3. 评价基因转化技术在微生物中的可行性。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、显微镜等；2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、质粒载体、抗生素等；3. 实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）。
四、实验方法1. 提取目的基因：采用DNA提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA，通过PCR技术扩增目的基因；2. 构建重组质粒：将目的基因插入到质粒载体中，通过连接酶将两者连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：采用热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察菌落生长情况；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，并通过测序验证其正确性。
五、实验结果1. 提取目的基因：通过PCR技术成功扩增出目的基因，片段大小与预期相符；2. 构建重组质粒：通过连接酶将目的基因与质粒载体连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：通过热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到转化子；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察到部分菌落生长；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，结果与预期相符；通过测序验证，目的基因正确插入到质粒载体中。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了基因转化，证明了基因转化技术在微生物中的可行性；2. 实验过程中，热冲击法是一种有效的转化方法，转化效率较高；3. 实验结果表明，通过PCR技术和测序验证，目的基因已成功导入宿主细胞，为后续研究提供了基础。
植物基因工程
思 考 题
1、简述利用农杆菌介导的转化法进行植物转基因的原 理。 2、植物转基因的方法有哪些？
3、用于药用蛋白大规模生产的高等哺乳动物受体细胞 是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势是什么？ 4、如何实现在烟草中表达有活性的小鼠的免疫球蛋白？ 请设计可行的实验方案予以说明。 5、如何评价基因工程对人们的生产生活产生的影响？
色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。
三、农杆菌介导法
Ti质粒：根癌农杆菌体内的一个大的致瘤质粒。
当根癌农杆菌感染植物的时候，菌体本身并不进 入植物细胞内，而仅是Ti质粒中的一部分被称之为
“T-DNA”的DNA片段进入寄主细胞并插入基因组
中，T-DNA中的基因利用植物的酶系统进行转录
和翻译，其表达产物可诱发植物产生肿瘤。
整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中
得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状 的技术体系。
高等植物基因工程包括两个方面：
高等植物转基因技术，目的是农作物遗传性状 改良； 高等植物细胞基因表达技术，目的是小分子化
合物及蛋白多肽物质大规模生产。
目前种植的转基因作物：大豆、棉花、油菜、玉米。 我国自行研制的转基因作物：转基因耐储存番茄、 转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜椒、抗病毒
一、转基因动物技术
1、动物基因工程载体： 质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
2、基因转移技术： 物理转染法 化学转染法 病毒感染法
二、转基因动物制备（略） 三、转基因动物的应用与未来
转基因动物的应用： 提高动物的生产性能 动物生物反应器 异种器官移植 基础研究
植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因（nptII）——Kanr，G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）——Cre
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
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2.植物基因转化的受体
原生质体 悬浮细胞 胚性愈伤组织 胚状体 叶片切块 其它受体：如花、子房、离体条件下的 子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花 粉等
3.植物转基因的方法
外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法 病毒介导法 外源基因的直接转化法 化学诱导DNA直接转化 物理法诱导DNA直接转化 花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）
组培条件 简单 嵌合体比 有 例 操作复杂 简单 性 设备要求 便宜 工作效率 高 单子叶植 少 物应用
4.植物基因转化系统的选择原则
对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农 杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且 转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。 原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，因为其优点 是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。 多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源 DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提 高转化率。 子房中有较大单胚珠的植物如核果类植物，宜试用显微注射法， 因为将外源DNA直接注入卵细胞的可能性较大。 转化难度大的植物，即对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困 难的植物，应采用基因枪法。 根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以整体植株为 试材，则应采用注射法和花粉管通道法；以叶片为外植体，则 应用农杆菌载体叶盘法或基因枪法。
根癌农杆菌（Ti质粒）
Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，Ti 质粒具有五个主要功能区域，它们分别是TDNA、质粒转移(plasmid transfer)、冠瘿碱代 谢(opine catabolism)、复制原点(ori)和毒性区 域(vir)。 T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体 上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界 处的25bp不完全直接重复(imperfect direct repeats)，右端的序列称为右界(right border, RB), 左端的为左界(left border,LB)。T-DNA区 域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基 因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至 LB内的序列转移并整合到植物基因组。 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。
植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用 土壤农杆菌的毒性区基因被激活
T-DNA的切割和T复合物生成
T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进 入植物细胞 T-DNA整合到植物染色体上
农杆菌的 活化
挑单克隆
收集细胞
用液体MS培 养基重悬细 胞
将预培养的 外植体放 入菌液中 侵染
取出外植体在 无菌滤纸上 吸干菌液
3.3.2物理法诱导DNA直接转化
物理转化方法是基于许多物理因素对细 胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外 源DNA导入细胞。它不仅能够以原生质 体为受体，还可以直接以植物细胞乃至 组织、器官作为靶受体，因此比化学法 更具有广泛性和使用性。 常用的物理方法有电激法、超声波法、 显微注射法和基因枪法。
常用植物基因转化方法特点比较
转化方法 农杆菌法 PEG法 受体材料 完整细胞 宿主范围 有 原生质 体 无 复杂 无 简单 便宜 低 可行 电击法 原生质 体 无 复杂 无 复杂 昂贵 低 可行 微针注射法 原生质体 无 复杂 无 复杂 昂贵 低 可行 基因枪法 完整细胞 无 简单 多 复杂 昂贵 高 广泛 花粉管通道法 卵细胞 有性繁殖植物 无 无 简单 便宜 低 广泛
第五讲 植物外源基因导入方法 及转化子的检测
1.概述
人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变 异来创造新物种和新品种。但常常存在着杂交 不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在 诱变的非定向性。 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之 一。它是指用人工分离和修饰过的外源基因通 过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物 细胞中并得到整合和表达，并通过对转化植株 的鉴定选择，从而使其遗传性状发生改变的技 术。创造出人类所需要的新品种或新物种。 外源DNA通过载体介导实现其转化的系统称之 为基因载体转化系统。
PEG介导基因转化 脂质体介导基因转化
PEG介导基因转化
PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸、磷 酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。 PEG通过电荷之间的相互作用,与DNA形成紧密复合物,植 物细胞通过内吞作用吸收这些复合物，一般PEG浓度较低 时,不会对原生质体造成伤害,而获得的转基因植株。 来自同1个细胞,避免了产生嵌合转化体,转化稳定性和重复 性好,容易选择转化体，受体植物不受种类的限制。 但对原生质体培养和再生困难的植物难以利用,且转化率低, 一般在10-5~10-6。 这种方法首先用在模式植物烟草上,转导象Ti质粒那样比较 大的质粒。在添加PEG和外源DNA时,人们已成功地将外源 基因整合到原生质体基因组,并得到表达，利用原生质体的 全能性,目前此种方法已在多种禾谷类作物如水稻，大麦， 玉米及一些双子叶植物中获得了转基因植株。
显微注射介导基因转化
显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术， 其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动 物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的 移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细 胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很 快，并在理论技术上有所创新。 其原理比较简明，是利用显微注射仪将外源DNA 直接注入受体细胞质或细胞核中。显微注射的一 个重要问题是必须把受体细胞进行固定。 转化的成功率高 可以省去选择性标记的麻烦
超声波所特有的机械作用，热化作用和空化 作用，穿透力大，在液体和固体中传播衰减 小，界面反射造成叶片组织受超声波作用的 面积较大等特点，使得转化效率较高。 该方法有以下优点，操作简单，设备便宜， 不受宿主范围限制，转化率高等。与其他方 法相比具有更大的潜力，但该转化系统尚待 进行深入研究，使之完善。
微注射法：一般适合于较大花的农作物 如棉花等。利用微量注射器将基因溶液 注射进入受精子房 柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液 滴加在柱头上 花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒， 让花粉粒吸入基因，然后授粉。
优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵 或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原 生质体等组织培养和诱导再生植株等一 套人工培养过程。方法简便；单、双子 叶植物均可应用；育种时间短。 这一技术局限欲开花时间才能应用；对 DNA大小纯度要求高。机理？
靶细胞或组织的预处理 微粒子弹的制备 装备基因枪 轰击 过渡培养 进行筛选培养或直接分化再生植株
PDS-1000 | He System
便携式基因枪
基因枪法转化的优点有：
无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感， 限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。 靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细 胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速
共培养
在含有选择压力 的培养基上诱导 细胞分化，形成 转化芽
诱导芽生长
生根，形成 转化植株
3.2病毒介导法
病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体“植物 病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中,通过病 毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。目前正 在研究发展的植物病毒载体系统有3种: 单链RNA植物病毒载体系统,是以单链RNA为模板经反转录 酶作用合成双链的cDNA,将其克隆到质粒或粘粒载体上,把 外源基因插入到病毒的cDNA部分,通过体外转录,将带有外 源基因的病毒DNA感染并进入植物寄主细胞。 单链DNA植物病毒载体系统,是由单链环状DNA分子组成, 一般存在成对的2个病毒颗粒，这种二连基因组可以把外源 基因插入其中1种DNA上而不影响另1种DNA基因组的复制。 双链DNA植物病毒载体系统,是将其病毒基因组中对病毒繁 殖非必需的1段核苷酸序列去掉,换上1小段外源DNA而不影 响病毒基因组正常包装”用这样重组的病毒载体感染植物 细胞以获得外源基因的转移。
电击法的转化效率与化学法相似。它除 了同样具有PEG原生质体转化的优点外， 还具有操作简便，DNA转化效率高，特 别适于瞬时表达的研究。缺点是造成原 生质的损伤。
超声波介导基因转化
超声波基因转化的基本原理是利用低声强脉 冲超声波的物理作用,击穿细胞膜造成通道,使 外源DNA进入细胞。 操作过程：取无菌的试管苗中部展开的叶片， 切成小块，并在叶片上针刺若干小孔，放入 超声小室中。同时加入5%DMSO缓冲液3ml， 质粒DNA20μg/ml 及鲑鱼精DNA40μg/ml ， 室温下超声处理30分钟。
但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。 且形成 多拷贝
3.4花粉管通道法
花粉管通道法是将外源的DNA片段在自 花授粉后的特定时期注入柱头或花柱， 使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转 化受精卵或其前后细胞。这一技术可以 应用于任何开花植物。该方法是有我国 科学家周光宇等（1983）建立并在长期 科学研究中发展起来的。
病毒载体比较小,便于在实验中操作,而且这类载体只 要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞,外 源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。 但是病毒载体的容量有限,不能包装大片段的外源 DNA基因组,寄主范围窄,复制稳定性差,转录和复制机 理复杂。 目前,用的较多的是花椰菜花斑病病毒(CaMV)和番茄 金花叶病毒(TGMV)。此法需要注意的是其他病毒侵 染植株后可能会跟所用的载体病毒之间发生信息交换, 进而导致载体病毒重新获得其致病能力”因此,其潜 在的危害性必须予以足够的重视。