植物外源基因转化方法及转化子的检测
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
42
Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
43
外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
40
mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
41
marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
植物重组实验报告模板
一、实验名称植物重组实验二、实验目的1. 掌握植物重组技术的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞。
3. 观察和分析重组植物的表型特征，验证基因表达。
三、实验原理植物重组技术是指利用基因工程技术将外源基因导入植物细胞，并通过组织培养等方法使其在植物体内表达的过程。
实验原理主要包括以下几个方面：1. 基因表达调控：通过基因重组技术，将目的基因与载体连接，再将载体导入植物细胞，使其在植物体内表达。
2. 植物组织培养：利用植物组织培养技术，将导入外源基因的细胞培养成植株。
3. 分子生物学检测：通过分子生物学方法，如PCR、RT-PCR等，检测目的基因在植物体内的表达情况。
四、实验材料1. 植物材料：受体植物种子、叶片等。
2. 基因材料：目的基因、载体等。
3. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶等。
4. 试剂：DNA marker、Taq酶、dNTPs、Tris-HCl缓冲液等。
5. 仪器设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、超净工作台、培养箱等。
五、实验步骤1. 目的基因的克隆：设计引物，利用PCR技术扩增目的基因，并通过限制性内切酶进行酶切，连接到载体上。
2. 载体构建：将目的基因与载体连接，构建重组载体。
3. 重组载体的鉴定：通过PCR、酶切等方法，鉴定重组载体的正确性。
4. 农杆菌转化：将重组载体导入农杆菌，制备转化子。
5. 转化子的筛选：利用抗生素筛选法，筛选出含有重组载体的转化子。
6. 转化子的再生：将转化子接种到培养基上，进行组织培养，获得转化植株。
7. 分子生物学检测：利用PCR、RT-PCR等方法，检测目的基因在转化植株中的表达情况。
8. 表型观察：观察转化植株的生长发育、生理生化特性等，分析基因表达效果。
六、实验结果与分析1. 目的基因的克隆：通过PCR扩增，成功获得目的基因。
2. 载体构建：通过酶切、连接等操作，成功构建重组载体。
3. 重组载体的鉴定：通过PCR、酶切等方法，验证重组载体的正确性。
转化子筛选方法
转化子筛选方法所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移,使受体细胞表现新的遗传性状。
将经转化后的细胞在选择性培养基中培养,即可筛选出转化体（transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
一.a互补所谓基因内互补作用，在LacZ体系中，是指二个彼此互补的突变基因(突变体1缺失LacZ近操作基因区段LacI；突变体2带有完整的近操纵基因而无β-半乳糖苷酶活性），它们编码产生的无活性的多肽产物，但由于二个突变体之间通过α肽互补作用可呈现有功能的β—半乳糖苷酶活性, 进而可分解底物X—gal(5-溴-4-氯—3-吲哚-β—D—半乳糖苷）而产生半乳糖和深蓝色的底物5-溴—4—氯-青定蓝, 使菌落呈现出蓝色反应。
然而，当外源基因DNA片段插入载体中LacZ α肽区段的多克隆位点后，就会阻断α序列的读码结构，使其编码的α肽失去活性，使重组子所在的细菌不能完成α-互补，因此带有外源基因重组子的细菌形成白色菌落。
根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可以检测和筛选出携有外源基因重组子克隆。
此法又称蓝白筛选法。
二.杂交筛选该法是从基因组文库中筛选目的基因的首选方法。
将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。
菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板，它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。
因此，能够进行重复筛选，效率高,可靠性强,而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。
2。
斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来。
2）抽提纯化，蛋白质、杂DNA等减少，所以能得到更为确切的结果，既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。
3。
Southern blot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能鉴定整个重组子中是否会有与探针互补的同源片段, 而Southern blot杂交能将同源片断定位于基因.三.插入失活根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA 分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程
1.制备基因载体：首先要确定所需转入植物的基因，然后将该基因克隆到适当的基因载体中，如农杆菌介导的转化系统中常用的质粒载体。
2. 构建转化质粒：将基因载体与其他必需的元件如启动子、终止子、选择标记等组装成转化质粒。
3. 制备植物材料：选择合适的植物作为转基因植物的母本，如经济作物或模式植物。
4. 农杆菌介导的转化：将构建好的转化质粒通过农杆菌注入到植物的叶片、茎或愈伤组织等处，利用农杆菌的生物学特性，在植物细胞中导入转化质粒。
5. 筛选转基因植物：通过在培养基中加入相应的选择标记，筛选出已经被转化的植物细胞，进而培育出转基因植物。
6. 鉴定转基因植物：通过PCR、Southern blot等分子生物学技术鉴定转基因植物是否成功，同时进行表型分析，确定转基因植物的性状和稳定性。
- 1 -。
基因转化小实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因转化是分子生物学领域的一个重要技术，它通过将外源基因导入宿主细胞中，使宿主细胞表达外源基因所编码的蛋白质。
基因转化技术在基因工程、生物制药、农业等领域具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究基因转化技术在微生物中的可行性，以期为后续研究提供参考。
二、实验目的1. 了解基因转化技术的基本原理和操作步骤；2. 掌握基因转化实验的操作方法；3. 评价基因转化技术在微生物中的可行性。
三、实验材料1. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、显微镜等；2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、质粒载体、抗生素等；3. 实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）。
四、实验方法1. 提取目的基因：采用DNA提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA，通过PCR技术扩增目的基因；2. 构建重组质粒：将目的基因插入到质粒载体中，通过连接酶将两者连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：采用热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察菌落生长情况；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，并通过测序验证其正确性。
五、实验结果1. 提取目的基因：通过PCR技术成功扩增出目的基因，片段大小与预期相符；2. 构建重组质粒：通过连接酶将目的基因与质粒载体连接，得到重组质粒；3. 转化宿主细胞：通过热冲击法将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到转化子；4. 挑选转化子：在含有抗生素的培养基上培养转化子，观察到部分菌落生长；5. 验证转化子：通过PCR技术检测转化子中的目的基因，结果与预期相符；通过测序验证，目的基因正确插入到质粒载体中。
六、实验讨论1. 本实验成功实现了基因转化，证明了基因转化技术在微生物中的可行性；2. 实验过程中，热冲击法是一种有效的转化方法，转化效率较高；3. 实验结果表明，通过PCR技术和测序验证，目的基因已成功导入宿主细胞，为后续研究提供了基础。
植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因（nptII）——Kanr，G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）——Cre
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
转化子的筛选和鉴定
菌落噬菌斑原位杂交法
菌落原位杂交法的基本操作：
影印
用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用X光胶片覆盖薄膜感光
感光
杂交
洗涤
克隆DNA序列检测
菌落噬菌斑原位杂交法
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
将外源DNA片段插在EcoRI位点： Pst I 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr
将外源DNA片段插在BamHI位点：
Apr
Tcr
pBR322
4363 bp
ROI ROP
Sal I Bal I
非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片 段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因 此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定 目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工 作量极大，实验成本也高。
克隆DNA序列检测
限制性酶切图谱法
全酶解图谱法：
或者： 1.0 kb + 5.7 kb
1.0 kb BE
0.8 kb PB
4.0 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI lacZ’
用PstI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb
或者： 0.8 kb + 5.9 kb
5' P
OH 3'