植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
43
外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
转基因植物的筛选与鉴定
转基因植物的筛选与鉴定随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
标签：拟南芥；转基因植物；筛选1 文献综述1.1 转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物的技术[1]。
从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2 基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要求。
每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。
1.3 本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。
借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。
2 转基因植物的筛选与鉴定2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥2.1.2 载体与菌株重组表达载体PMDC150-35S（由实验室提供）、农杆菌菌株GV31012.1.3 主要试剂75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素（重组表达载体含有的抗性）、利福平2.1.4 培养基LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L琼脂（只固体培养基添加）1/2MS培养基2.2 实验方法2.2.1 拟南芥种植：将种子放在浸过水的滤纸上，放在4℃的冰箱中，不见光培养24小时，然后取出种子种在营养土里，在光照强度8000Lux，温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。
植物的基因工程和转基因技术
植物的基因工程和转基因技术植物的基因工程和转基因技术是现代生物学领域中一项重要的研究内容。
通过利用基因工程和转基因技术，科学家们能够对植物进行遗传改良，从而实现提高作物产量、抗虫病和抗逆性能等目标。
本文将就植物基因工程的原理、应用和潜在的问题进行探讨，以便更好地理解这一领域的重要性和影响。
一、基因工程的原理基因工程是指通过分子生物学技术对生物体的基因进行改造的过程。
植物基因工程的核心是基因的克隆和转移。
首先，科学家们需要从源植物中提取目标基因，然后将其插入到目标植物的染色体中。
这一过程需要利用酶切与黏合技术来切割和粘合DNA分子，从而实现基因的克隆和转移。
二、转基因技术的应用转基因技术是基因工程的一种重要手段，通过这种技术，科学家们可以将外源基因导入到目标植物中，从而使其具备一些新的性状或特性。
转基因技术在农业和食品生产领域有着广泛的应用。
例如，利用转基因技术，科学家们可以培育出具有抗虫病、抗逆性以及更高产量的转基因作物。
此外，转基因技术还可以用于培育抗除草剂的作物，从而降低农药的使用量，并提高农作物的耐草剂能力。
三、转基因技术的优势和潜在问题转基因技术在农业和食品生产中具有许多优势。
首先，转基因作物可以显著提高农作物的产量，从而满足人们日益增长的粮食需求。
其次，经过基因改良的作物具有更好的抗虫、抗逆性能，能够减少农药的使用，对环境友好。
此外，转基因技术还可以提高农作物的营养价值，改善其口感和储存能力。
然而，转基因技术也存在一些潜在的问题和争议。
首先，转基因作物可能对生态系统造成潜在的风险，例如，转基因植物的杂交可能会导致与野生植物的杂种，从而对生态多样性产生负面影响。
其次，由于转基因技术的高昂成本，这些技术可能会加大农民的经济负担。
此外，一些人对转基因技术持有担忧，担心食用转基因作物可能对人类健康产生潜在的风险。
四、基因工程和转基因技术的发展前景尽管存在一些潜在问题，基因工程和转基因技术仍然具有广阔的发展前景。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
生物技术 园艺植物基因工程步骤
生物技术园艺植物基因工程步骤
园艺植物基因工程是指通过生物技术手段对园艺植物的基因进行改变或调控，以获得所需的遗传特性。
其步骤主要包括以下几个方面：
1. 目标设定：确定要改变的遗传特性和目标基因，例如提高植物的产量、抗性、品质等。
2. 基因克隆：从目标植物中提取DNA，并使用分子生物学技术将目标基因扩增、纯化，以获得目标基因片段。
3. 基因构建：将目标基因片段插入植物基因工程载体（例如农杆菌载体），并利用适当的限制性内切酶将其与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
4. 转化方式选择：选择适合的转化方法将重组DNA导入目标植物细胞，主要有农杆菌介导转化、生物弹射法或冷冻融合法等。
5. 遗传转化：将经过构建的重组DNA导入植物细胞，使目标基因插入植物染色体，形成转基因植物。
6. 试管繁殖：对转基因植物进行离体培养，通过细胞分裂和组织增殖等技术，大规模繁殖转基因植物。
7. 筛选和鉴定：利用分子生物学和生化分析等技术对转基因植物进行鉴定和筛选，确认目标基因的存在和表达情况。
8. 田间试验和推广：在试验田或实际种植场进行转基因植物的田间试验，评估其生长发育、产量、品质和抗性等性状，同时进行安全性评估和环境风险评估。
9. 商业化推广：通过权威部门的安全评估和监管审核，将合格的转基因植物品种进行商业化推广，使其广泛应用于园艺产业。
需要注意的是，园艺植物基因工程步骤可能会因具体目标和植物而有所差异，以上步骤仅供参考。
植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因（nptII）——Kanr，G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）——Cre
植物转基因技术原理及要点
通过将与生物燃料生产相关的基因导入植物中，使植物能够生产生物燃料。例如，转基因生物燃料甘蔗和藻类。
THANKS
谢谢
基因枪法
通过物理手段将目的基因 导入植物细胞，常用金粉 或钨粉作为载体。
微管注射法
将目的基因直接注射到植 物细胞内，再通过植物细 胞培养再生出转基因植株。
转基因植物的安全性评价
生态安全评价
评估转基响、基因漂移等。
食品安全评价
评估转基因植物对人类健 康的潜在影响，如食品中 营养成分的改变、毒理学 安全性等。
产量高
转基因技术可以增加植物的光合作用 效率，提高产量，有助于解决全球粮 食安全问题。
品质优良
转基因技术可以改善植物的品质，如 增加营养价值、改善口感等。
转基因植物的缺点
生态风险
转基因植物可能对非目标生物产生影响，破 坏生态平衡。
过敏反应
转基因植物可能产生新的过敏原，引发过敏 反应。
食品安全问题
关于转基因食品的安全性存在争议，长期食 用可能对人体健康产生影响。
高产优质转基因植物
高油酸转基因植物
通过将高油酸相关基因导入植物中，提高植物油中的油酸含量，从而提高油的品质和稳定性。例如， 转基因高油酸油菜和花生。
高纤维转基因植物
通过将高纤维相关基因导入植物中，提高植物纤维的产量和品质。例如，转基因高纤维亚麻和大麻。
其他应用领域的转基因植物
荧光转基因植物
通过将荧光蛋白基因导入植物中，使植物在黑暗中发出荧光，具有观赏价值。例如，转基因荧光烟草和紫茉莉。
植物转基因技术要点
目的基因的选择与获取
目的基因选择
选择对植物生长、产量、抗性等有积 极影响的基因作为目的基因，以提高 转基因植物的性状。
植物基因工程实验教案：遗传转化技术的应用和优化
植物基因工程实验教案：遗传转化技术的应用和优化植物基因工程是一种将目标基因移入植物细胞内的方法，以实现改良作物品种的过程。
这一技术可以应用于许多方面，如增强作物产量、提高作物品质、促进作物抗病抗虫能力等。
植物基因工程是一个极具潜力的领域。
本文将介绍植物基因工程实验教案中的遗传转化技术的应用和优化。
一、遗传转化技术遗传转化技术是一种将外源基因转移入植物细胞中的方法，该方法包括四个主要步骤：选择载体、制备载体、转化载体和鉴定基因。
选择载体：目前用于植物基因工程的两种载体是农杆菌和冷冻冻融法。
农杆菌转化法是最常用的方法之一，农杆菌以同源重组的方式在植物细胞中形成感染斑。
农杆菌将外源基因植入植物细胞中，目标基因将被插入植物细胞的染色体中。
制备载体：载体是一种可以将外源基因植入植物细胞内的DNA分子。
在制备载体的过程中，需要用到回收携带目标基因的载体。
常用的载体包括质粒和病毒，质粒是一种带有目标基因的圆形DNA分子，可以将目标基因直接植入质粒中。
转化载体：转化载体是指将目标基因输送至植物细胞内的过程。
转化方法主要有两种：物理转化和生物转化。
物理转化是指通过高斯粒子加速器等物理手段将目标基因输送至植物细胞内；生物转化是指使用农杆菌或病毒将外源基因输送至植物细胞内。
鉴定基因：鉴定基因是指确定转化后的植物细胞中是否成功植入了外源基因。
通常使用PCR和Southern杂交等方法对植物细胞进行鉴定。
二、遗传转化技术的应用1. 增强作物产量：遗传转化技术可以实现植物细胞的营养分配和代谢的调节，从而提高作物的生长速度和生产力；2. 提高作物品质：通过遗传转化技术，可以改善作物的色、香、味等特征；3. 促进作物抗病抗虫能力：外源基因的应用可以帮助作物提高其对病菌、虫害等的抵抗力；4. 创建新的生物技术：可以通过遗传转化技术创建新的生物技术，例如转基因药物、疫苗等。
三、遗传转化技术的优化虽然遗传转化技术在基因工程领域中应用较为广泛，但是该技术仍存在一些问题。
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植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定〖实验目的〗1．了解创建烟草突变体库的方法；2．理解每种方法的基本原理；3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。
〖实验原理〗随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。
植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。
在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。
与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。
最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。
烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。
突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。
通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。
T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR)利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。
TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR 方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。
实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草，以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的已知序列对比，获得功能基因的全序列。
〖仪器、材料和试剂〗（一）仪器高速冷冻离心机，PCR仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱，紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader，恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。
（二）材料烟草幼苗，含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。
（三）试剂1. 2×CTAB提取液100mmol/L Tris-HCl pH8.02％（w/v）CTAB1.4mol/L NaCl40mmol/L b-巯基乙醇20mmol/L EDTA2. TE缓冲液10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA3. 50´TAE电极缓冲液1000mlTris 54g硼酸27.5g0.5mol/L EDTA 20ml4. 10％次氯酸钠5. 氯仿：异戊醇(V:V，24：1)6. 70％乙醇7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）100ml8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾，11.5ml 11.5％冰乙酸，28.5ml无菌水100ml9. 溶液II：分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各30ml），用时1:1混合10. LB液体培养基配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g酵母提取物(bacto-yeast extract) 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1升，121℃高压灭菌20分钟。
11. MS基本培养基大量元素mg/L 微量元素mg/L 有机营养mg/LNH4NO31650 KI 0.83 甘氨酸 2.0KNO31900 H3BO3 6.2 烟酸0.5 CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇（Vb6）0.5 MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素（Vb1）0.lKH2PO4170 NaMoO4·2H2O 0.25 肌醇100CoCl2·6H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025FeSO4·7H2O 27.8配制方法母液：大量元素（50×）400mL硝酸铵33g；硝酸钾38g；磷酸二氢钾3.4g；七水合硫酸镁7.4g；铁元素（100×）200mL七水合硫酸亚铁0.556g；七水合EDTA二钠0.746g；有机营养（100×）200mLGly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇2g；烟酸0.010g；微量元素（1000×）200mL碘化钾166mg；硼酸1240mg；一水合硫酸锰3380mg；七水合硫酸锌1720mg；二水合钼酸钠44mg；五水合硫酸铜5mg；六水合氯化钴5mg；氯化钙（50×）400mL 氯化钙8.8g12. 愈伤组织诱导与分化培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA＋0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL；以上激素母液均为0.5mg/mL13. 筛选培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA ＋0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂＋100mg/L羧苄青霉素14. 抗生素母液的配制KANA（50mg/mL）1g KANA溶于20mL蒸馏水；RIF（50mg/mL）0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50mL；STR（30mg/mL）0.6g STA溶于20mL蒸馏水；羧苄青霉素（100mg/mL）2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。
潮霉素B（50mg/mL）可以直接购买〖实验步骤〗I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生1. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。
在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。
无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。
将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用6mm打孔器凿成圆盘。
2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度，诱导烟草叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中，每周定期观察并更换培养基。
II 转基因烟草的培养1. 农杆菌的培养：将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中（Kana50ug/ml、RIF、STR），27℃，180r／min振摇培养过夜。
将2ml菌液转入20ml LB液体培养基中，与上述的相同条件培养6小时左右，使菌液达到OD600＝0.2～0.5，用来侵染烟草叶片。
2. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。
在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。
无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。
将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用6mm打孔器凿成圆盘。
3. 愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。
将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液（如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗1～2次）。
4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天。
5. 筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上（100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B，羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。
如果农杆菌生长未被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长）。
每隔3～4天继代一次，培养条件为，光照2000lx，温度26℃，日照16h。
4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化。
接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实验（无愈伤组织生长和器官分化）。
Ⅲ转基因烟草的检测1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，加入0.5mL65℃预热CATB抽提液65℃水浴抽提30min，间歇混匀；2. 取上清各加入0.5mL氯仿异戊醇（体积比24:1）去除蛋白，12000rpm离心10min；3. 取上清加入1体积预冷异丙醇至-20℃出沉淀30～60min，8000rpm离心15min；4. 弃上清，70%乙醇洗涤2次干燥，避光保存；5. 加入15μL蒸馏水溶解并电泳检测（0.7%琼脂糖凝胶电泳）；6. 提取pMDC83rc质粒：（1）3-5ml过夜菌12000rpm离心1min，弃上清；（2）加300μL预冷溶液I，颠倒混匀6-8次；（3）加300μl新鲜不预冷溶液II，颠倒混匀6-8次；（4）加300μl预冷溶液III，颠倒混匀6-8次；（5）12000 rpm 15min，转移上清液；（6）加入0.5倍体积的异丙醇，混匀，室温放置3min，如上离心12min；（7）弃上清，70%乙醇洗沉淀；（8）空气干燥，20ml 蒸馏水溶解，-20℃贮存。