植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
植物遗传转化技术
binary vector
• 包括mini-Ti质粒（T-DNA边界，缺失Vir区）和 helper Ti质粒（含有Vir区缺失T-DNA边界，相当 于co-integrated vector 的disarmed Ti质粒） mini-Ti质粒：pBin19，pCAMBIA系列 helper Ti质粒：EHA105，LBA4404（pAL4404）
26
Co-integration plasmid
• 一元载体系统A plasmid based on pBR322 used to clone gene of interest
• A Ti-based vector: pGV3850 (LB, RB, most of T-DNA replaced by pBR322)
Left border
Right border
12-24 kbp
vir genes
Opine
ori
catabolism
15
3. 创伤诱导分子
• 是一类可溶性的小分子酚类化合物 • 乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）、羟
基乙酰丁香酮（acetosyringone，OH-AS） • A.t: recognition and chemotaxis （趋化性）
• Left and right border (LB\RB):TDNA左右两侧各有一段25bp的重复 序列，在T-DNA的整合中起重要作用
• Ori区(origin of replication)：该区段 基因调控Ti质粒的自我复制，故称之 为复制起始区。
T-DNA region
Auxin Cytokinin Opine
• T-DNA和vir基因参与，T-DNA上的基因与 T-DNA的转移及整合有关，因为它不编码 T-DNA转移的产物。
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。
一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。
常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。
1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。
该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。
首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。
在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。
2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。
将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。
在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。
3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。
通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。
二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。
常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。
1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。
它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。
在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。
通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。
植物生物技术中的组织培养与遗传转化
植物生物技术中的组织培养与遗传转化植物生物技术是一门通过应用生物学原理和技术手段，对植物进行改良和利用的学科。
其中，组织培养与遗传转化技术是植物生物技术中的重要内容。
本文将介绍植物组织培养和遗传转化的概念、原理及应用，并探讨其在农业、医药、园艺等领域的潜力。
一、植物组织培养植物组织培养是指将植物的组织、器官或细胞在无菌条件下培养与繁殖的技术。
它是一种有效的植物繁殖和繁衍方式，通过调控培养基、激素和营养物质的配比，可以促进植物组织的生长和分化，培养出大量的植株。
组织培养技术被广泛应用于植物繁育、种子无性繁殖、快速繁殖珍稀植物等方面。
在植物组织培养中，最常用的培养基是植物激素和营养物质的混合物。
不同植物所需的培养基成分和比例各异，因此在组织培养中需要对培养基进行优化和调整。
此外，培养过程中的温度、光照和湿度等因素也对植物的生长和分化起着关键作用。
二、遗传转化技术遗传转化技术是指将外源基因导入到植物细胞或组织中，并使其在植物体中表达出来的技术。
通过遗传转化，可以实现植物抗病虫害、耐逆性等性状的改良，提高作物的产量和质量。
遗传转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和冷冻法等。
基因枪法是一种直接将外源基因通过高速微颗粒轰击进入植物细胞的方法，适用于多种植物。
农杆菌介导法则是将外源基因导入农杆菌中，再通过感染植物组织或细胞，使植物细胞中的农杆菌携带和表达外源基因。
冷冻法即将植物组织置于低温条件下，使细胞膜破裂，利用裂解的细胞膜将外源基因转移到植物细胞内。
三、植物生物技术的应用植物生物技术的应用具有广泛的前景和潜力。
在农业领域，通过植物组织培养和遗传转化技术，可以培育出抗虫、抗病、耐逆的转基因作物，提高作物产量和品质，为农业生产带来革命性的变化。
在医药领域，植物生物技术也被广泛应用于植物药物的研发和生产，通过植物组织培养和遗传转化技术，可以获得大量的高效、低成本的药物原料。
在园艺领域，植物生物技术可以用于珍稀植物的繁殖和保护，提高园艺植物的观赏价值。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。
步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤
植物遗传转化是指通过人为手段，将外来基因导入植物细胞内，使其产生新的遗传特征。
植物遗传转化的步骤主要包括以下几个方面： 1. 基因载体构建：基因载体是将所需基因导入植物细胞内的载体，包括质粒、病毒、人工染色体等。
构建基因载体需要选择适当的载体和适合的启动子、终止子、选择标记等元件。
2. 转化体系建立：植物遗传转化需要建立一套合适的转化体系，包括培养基的配制、细胞培养和再生体系等。
转化体系的搭建需要考虑到不同物种、基因载体和转化方法的特点。
3. 基因导入：基因导入可以通过直接基因转移、基因炮击、农
杆菌介导转化等手段进行。
其中，农杆菌介导转化是最常用的基因导入方法。
在基因导入过程中，可以使用选择标记来筛选生产基因转化植株。
4. 识别和筛选：基因转化后的植物细胞需要进行识别和筛选。
常用的识别方法包括PCR检测、Southern杂交、Northern杂交等。
筛选方法可以通过细菌耐草酸和遗传标记等手段进行。
5. 品系选育：经过基因转化的植物需要进行品系选育，通过选
择有利的基因型和表型，后代将具有更好的遗传特征。
品系选育需要进行多代重复筛选，最终得到具有稳定表达和优良性状的转化植株。
6. 安全评价：基因转化后的植物需要进行安全评价，包括对植
物生长性状、代谢产物、土壤微生物等方面的评价。
安全评价是确保基因转化植物的生态安全性和食品安全性的重要环节。
园艺植物遗传转化载体的构建
03
终止子是位于目的基因 下游的一段DNA序列， 能够终止目的基因的转
录。
在园艺植物遗传转化中， 常用的终止子有
CaMV35S终止子和花椰 菜花叶病毒（CaMV）
35S终止子等。
终止子的选择对于目的 基因的表达水平和转录
效率具有重要影响。
复制子
01
复制子是用于在转化细胞中复制目的基因的元件， 通常来源于病毒或质粒。
02
在园艺植物遗传转化中，常用的复制子有来自SV40 的复制子和来自pBR322质粒的复制子等。
03
复制子的选择对于目的基因的拷贝数和表达水平具 有重要影响，同时也应考虑安全性因素。
03
园艺植物遗传转化载体的构建方法
质粒DNA的制备
提取质粒DNA
从宿主细胞中提取质粒DNA是构 建转化载体的第一步，常用的方 法有碱裂解法、煮沸法和高盐沉 淀法等。
纯化质粒DNA
提取的质粒DNA需要进行纯化， 去除杂质和核酸酶，以保证后续 酶切和连接的顺利进行。
检测质粒DNA质
量
通过电泳和紫外分光光度计等方 法检测质粒DNA的质量，确保其 纯度和浓度满足后续实验要求。
限制性酶切和连接
选择限制性内切酶
01
根据目的基因和载体的大小选择合适的限制性内切酶，以确保
酶切位点的准确性和后续连接的效率。
限制性酶切
02
将质粒DNA和目的基因分别进行限制性酶切，获得具有相同黏
性末端的片段。
连接反应
03
将酶切后的目的基因和载体进行连接，形成转化子。连接反应
的条件和时间对转化效率有重要影响。
转化子的筛选与鉴定
转化子筛选
将连接产物转化到受体细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定等方法 筛选阳性转化子。
第九章 植物遗传转化载体
第九章 植物遗传转化载体
一、植物遗传转化载体的种类和特点 二、农杆菌质粒载体系统的结构、功能和构建 三、植物病毒载体 四、叶绿体转化载体 五、常用的选择标记和无选择标记基因转化系统
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第一节、植物遗传转化载体的种类和特点
作为遗传转化载体必须具备的特点：
1、能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去（核基因组或细胞内） 2、它能提供被寄主细胞的复制和转录系统识别的DNA序列，以保证导入外源 基因能够在受体植物细胞内正常的复制和表达。
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植物遗传转化载体的种类
1、质粒载体：Ti质粒载体---共整合载体系统 ---双元载体系统（构建方式不同） Ri质粒载体 2、病毒载体系统：单链RNA病毒载体系统 单链DNA病毒载体系统 双链DNA病毒载体系统
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植物遗传转化
植物遗传转化植物遗传转化是指将一种基因从一种宿主植物移植到另一种植物中的过程。
这可以通过多种技术实现，包括蛋白质工程、病毒载体和质粒介导的遗传转化。
植物遗传转化的技术可以用来改变植物的性状，例如产量，耐旱性，抗病性，耐寒性，营养价值，等等。
它还允许转化植物中的基因，以改善其耐药性、耐酸碱性或其他性状。
植物遗传转化技术有着悠久的历史，最早可以追溯到使用放射性同位素来驯化植物的实验，其目标是改变植物的遗传特性，从而增加其产量。
今天，植物遗传转化的技术发展迅速，使得利用质粒介导的遗传转化技术来转移植物的基因变得越来越容易。
还有许多其他的方法，包括蛋白质工程，以及其他以病毒载体为媒介的形式，都在不断的发展和应用中。
植物遗传转化的应用在种植领域非常广泛。
这种技术可以用来增加植物抗病性，使得植物不容易受到病虫害、荒漠化或气候变化的侵袭；改善植物对营养元素的利用，改善植物的生长和发育；消除农业投入品，比如农药和化肥，使植物可以在较低的投入下获得较高的收入；改变植物的性状，比如口感、果实大小、颜色等，使得植物更受消费者欢迎；以及改变植物的耐寒性，以适应不同的气候条件，减少和消除对农作物收获量的不利影响。
随着植物遗传转化技术的发展，植物遗传转化在农业中的应用越来越广泛，许多农作物也在不断发展改造中。
植物遗传转化的技术已成为农业科学研究的重要组成部分，在当今的社会中得到了越来越多的应用，它不仅可以改善植物的效率，而且可以降低农作物的生产成本，最终提升农作物的抗病性、耐寒性、耐旱性和营养价值等性状，为世界人民提供健康、安全和有营养的生活所需。
如今，植物遗传转化技术已经成为人类运用自然环境生物资源的重要工具，但它仍然存在一定的风险。
因此，在开发和使用植物遗传转化技术之前，应当首先对技术进行全面的评估，确保它不会对自然生态、人类健康或其他有关部门造成不利影响。
同时，在开发和使用植物遗传转化技术的过程中，应当遵守有关法律法规，以确保植物遗传转化技术的安全、可靠和环保。
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农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
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二、发根农杆菌Ri质粒的结构和功能
Ri质粒：200kb-800kb，其基本结构也与Ti质粒相似，包括致瘤区 （Vir区）、T-DNA区和复制起点Ori。
根据其合成的冠瘿碱种类的不同可分为三类：农杆碱型、甘露碱 型和黄瓜碱型。
农杆碱型Ri质粒有两段T-DNA，即TL和TR，可以分别插入植物基因 组； 甘露碱型和黄瓜碱型Ri质粒只有单一T-DNA，甘露碱型和黄瓜碱型 Ri质粒的单一T区除其25bP边界重复序列外，其他部分与Ti质粒同 源性很低，但它们与农杆碱型Ri质粒的TL区有较高的同源性。
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第一节 植物遗传转化载体的种类及特点
一、植物遗传转化载体的特点
作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能： 1.能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去 2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，以保 证导入的外源基因能在受体植物细胞中正常复制和表达
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二、植物基因工程载体的种类
7
第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建
丁香酮）作用下才能启动表达；VirB、VirC、VirD和VirE是属
于诱导性表达的位点
➢ virG既为组成型表达，也具有诱导表达的特性，在信号分子的 诱导下，表达量提高10倍
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Vir区基因的功能：
VirA蛋白––帮助植物细胞接受植物信号分子 VirG蛋白––对毒性区的其他基因进行正调节 VirB蛋白––形成膜通道，使T-DNA转移到细菌细胞外 VirD蛋白––VirD1、 VirD2诱导T-DNA形成单股DNA片段，并形成复
根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能 名词：一元载体、双元载体、卸甲载体 叶绿体转化的优势与意义 遗传转化中常用的选择标记基因、报告基因
3
植物遗传转化的基础
植物遗传转化
也称为转基因技术 (transgene technology) 是指将人工分离和修饰过的外源基因导入生物体的基因组
中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术
该区段上编码的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故也 称作致毒区。T-DNA区与Vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一
Vir区段总长度大约35kb，由6个互补群组成，分别命名为VirA、 VirB、irC、VirD、VirE、和VirG。
Vir区中各个基因之间都是相互联系相互影响的，缺一不可。 当Vir基因与T-DNA分别位于两个不同的复制子上时，即Vir区与T-
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Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
DNA区分割开来以后， Vir基因仍然能够为T-DNA提供转移功能
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毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种
➢ 组成性表达：在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水
平； VirA属于组成型表达的位点
➢ 诱导性表达：即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受 伤组织时，植物细胞分泌的信号分子（乙酰丁香酮及羟基乙酰
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三、Ti质粒载体的改造
Ti质粒作为载体的可能性
能够自发地整合到植物的染色体上 能转化多种植物 强启动子：T-DNA的oPine合成酶基因上有一个强启动子，能启动
外源基因的表达
17
天然Ti质粒载体的缺点
分子量太大（200kb），基因工程中难以操作 限制性酶切位点太多，难以找到单一的限制性位点 T-DNA区致瘤基因产物使被转化的植物细胞成为肿瘤，阻碍细胞的分
vir 区
tra Ori区
Con区
11
（一）T-DNA的结构特点及功能
编码冠瘿碱的合成，能随机整合 到植物的染色体上。
长度一般为12-24kb，是Ti质粒 最重要的部分。
左右边界分别为25bP的重复序列 ，其中14bP是核心，是完全保守 的。
右边界对于致瘤必不可少。
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（二）Vir区的结构和功能：
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
2
第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
8
根癌农杆 菌侵染植 物后产生 冠瘿瘤
9
一、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
•Ti质粒(tumor induced Plasmid)是根癌农杆菌染色体外的遗传 物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95--156 x 106 D，约有150--200kb •依据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤种类的不同，Ti质粒可以分为四种 类型：章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型 （agrocinoPine）或琥珀碱型（succinamoPine）
合物（T-DNA-VirD2） VirE蛋白––与单链T-DNA结合（ 形成T复合物），保护T-DNA不被
胞外核酸酶降解转入植物细胞，整合到寄主基因组中 VirC蛋白––与切割单链T-DNA有关 VirF蛋白––协助T-DNA转移到宿主植物细胞中 VirH蛋白对植物产生的杀菌或抑菌物进行解读
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植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不涉及非目标累赘 基因，因而更具有针对性，可加快育种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制，扩大可利用的资 源库（动物、植物、微生物、人工合成基因均可利用）；
可创造出自然界所没有的新种质； 以转基因植物为主体的植物化工厂具有高效、低污染、可再生的优点。