植物遗传转化中选择标记基因的研究进展

植物基因工程实验技术

植物基因工程实验技术
编者: 赵燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月

前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1

目
实验一实验二实验三实验四实验五实验六实验七实验八实验九实验十附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
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植物基因转化常用方法

一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。 1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。 Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb 左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。 T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH） tmr由一个基因组成iptz： tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物，称为opines。它有三个成员： octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物 Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物 Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。

植物遗传转化大实验

植物遗传转化大实验一、实验目的与原理简介农杆菌介导的遗传转化系统是外源DNA进入植物细胞的最成功和应用最广泛的方法，农杆菌可浸染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至裸子植物。转化植物细胞的农杆菌主要有两类，即根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。已有研究表明，影响农杆菌介导植物基因转化的因素很多，农杆菌菌株、植物基因型和外植体、培养方法、不同的选择标记等因素都影响农杆菌介导的遗传转化。目前报道已有许多植物通过农杆菌的遗传转化获得了转基因植株或毛状根。二、发根农杆菌介导的遗传转化步骤 1．无菌组织的培养取组培苗幼嫩叶片，在超净工作台中切成0.5x0.5cm的方块，并在叶片上刻痕，接种于愈伤诱导培养基中，暗培养3周后作为受体。在农杆菌浸染前，将愈伤组织在无菌条件下切割成小块在愈伤诱导培养基上分别预培养，增加受体细胞的活性进而提高转化率。 2．农杆菌的培养在转化平板上挑取c58c1单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃振荡培养过夜；室温下4000rpm, 10min，弃上清夜，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右。 3．共培养剪取无菌苗的叶片和茎段，放入发根农杆菌MS悬液中浸泡5min，倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基MS上，光照培养2天。 4．毛状根的诱导和培养将共培养的外植体转入到1/2 MS + Cef 500mg/L培养基上光照培养。随时检测外植体的染菌情况，如出现细菌生长过多，须马上转移到新筛选培养基中培养。20天左右即可长出毛状根，剪取毛状根，接种于1/2 MS + Cb 250mg/L培养基上暗培养数周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌筛选培养基中继代筛选。三、毛状根的分子鉴定 1、毛状根基因组DNA提取。（采用CTAB法小量提取）。 2、转化基因PCR鉴定。四、实验说明能否成功地获得转基因植物，取决于起始材料对农杆菌的感受性、对转化细胞形成的新生组织的选择能力以及中选组织的再生能力。遗传转化时应该注意以下几点： 1、对农杆菌进行必要的诱导处理，注意培养条件、菌液浓度、侵染和共培养的时间等，在提高瞬时表达的同时要防止细菌的过度生长； 2、对再生植株的细胞起源需有明确的了解，在培养方法、培养基的设计上要有利于转化细胞的生长、分裂及植株再生；

农杆菌介导的植物转基因技术实验指导

农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。实验一培养基配制一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。二、实验方法第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose

（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。〖实验原理〗随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子

植物遗传转化研究进展

植物遗传转化研究进展重庆师范大学生命科学学院生物科学（师范）专业 2009级指导教师摘要：植物遗传转化是一项农业生物技术，它通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的全基因组中，并使之在受体细胞中得以充分表达。目前一些重要农作物转基因品种已经或即将投入到实际应用，随着研究的不断深入,本文对植物遗传转化的技术作出了新的展望。关键词：植物遗传转化；植物遗传转化方法；应用；进展 Abstract：Plant genetic transformation is a kind of agricultural biotechnology.It delivers to the whole-genome of receptor cells through a certain approach or technique to make the exogenous genes fully expressed in receptor cells. At present, genetically modified varieties of some important crops have been or are about to put into the practical use. with the deepening of the research,this paper makes a new outlook of the plant genetic transformation technology. Key words: Plant genetic transformation; the approaches of plant genetic transformation; application; progress 植物遗传转化是指以植物的器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株。遗传转化也称为转基因技术。转基因植物的研究始于20世纪70年代。到了20世纪80年代，由于基因操作技术的提高和目的基因构建模式等内容的基本完成，植物转基因技术便应运而生。1983年获得了第一例转基因烟草，使植物基因工程发生了质的飞跃，植物转基因技术也已经得到了广泛的应用和发展，人们开始对外源基因导入植物细胞的方法进行大量的探索，建立了多种方法用于植物的基因转化。目前应用最普遍的植物基因的遗传转化方法主要有农杆菌介导法和DNA直接转入法[1,2]。

五种常用的植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植

物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-

农杆菌介导的植物遗传转化研究进展

生物技术进展 2011年第1卷第4期260 265 Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯殯殯殯 2341 进展评述 Reviews 收稿日期：2011-08-30；接受日期：2011-10-11基金项目：国家自然科学基因项目（31070139）资助。作者简介：姚冉，硕士研究生，研究方向为遗传学。*通讯作者：张志芳，研究员，博士，博士生导师，主要从事基因工程研究。E-mail ：zhangzf@mail．caas．net．cn 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展姚冉1，2，石美丽1，潘沈元1，沈桂芳2，张志芳 2*1．徐州师范大学生命科学学院，江苏徐州2211162．中国农业科学院生物技术研究所，北京100081摘要：农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一。本文从农杆菌转化原理、菌株比较及载体发展入手，系统讨论了植物转化受体对转化效率的影响，同时分别综述了农杆菌介导转化技术在双子叶和单子叶植物转化应用中的最新进展。关键词：农杆菌；遗传转化；进展 DOI ：10．3969/j．issn．2095-2341．2011．04．06 Progress on Agrobacterium tumefaciens -mediated Plant Transformation YAO Ran 1，2 ，SHI Mei-li 1，PAN Shen-yuan 1，SHEN Gui-fang 2，ZHANG Zhi-fang 2* 1．School of Life Science ，Xuzhou Normal University ，Jiangsu Xuzhou 221116，China 2．Biotechnology Research Institute ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China Abstract ：In current ，Agrobacterium -mediated gene transferring is one of major methods used in genetic transformation of plants．This paper systematically reviewed the effect on plant transformation efficiency based on the introduction of the principle of this transformation ，comparison among different kinds of Agrobacterium strains and the development to transformation vectors．In addition ，the newly progresses on the Agrobacterium -mediated transformation of dicotyledonous and monocotyledons species transformation were also discussed ，respectively． Key words ：Agrobacterium tumefaciens ；genetic transformation ；progress 植物遗传转化（plant genetic transformation ）技术也称植物转基因技术，是应用DNA 重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术［1］。目前最常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源DNA 的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA 的目的。但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、外源DNA 整合机理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、遗传稳定性较差、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。农杆菌属于革兰氏阴性土壤杆菌，分根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes ）。根癌农杆菌中含有Ti 质粒，能诱发冠瘿瘤。发根农杆菌中含有Ri 质粒，可以导致受伤部位产生毛发状根。Ti 质粒（包括Ri 质粒）上有一段转移DNA （transfer DNA ，又称T-DNA ），受伤的植物细胞中产生的化学复合物可使农杆菌吸附于植物上，使T-DNA 转移到植物细胞内并整合到染色体上。目前大量研究工作的目标是明确农杆菌将外源DNA 导入受体细胞的分子机制，从而改进农杆菌菌株、质粒和转化技术，以进一步提高转化效率。由于植物受体在转化过程中的作用尚不十分明确，所以农杆菌在转化过程中如何进入植物细

常用的植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti 质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA 是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA 转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期

玉米遗传转化体系的研究进展

玉米遗传转化体系的研究进展摘要：植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得使外源基因稳定表达的可育植株。玉米作为世界上主要三大粮食作物之一, 是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料,在世界经济乃至人类生存方面占据肴举足轻重的地位，所以它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视，至今对玉米遗传转化的研究已经取得了一些成绩，本文主要针对近年来玉米遗传转化技术所取得的重要进展进行论述。主要包括玉米转化受体系统、转化方法及其优点与存在的问题以及对未来的展望等几方面论述玉米遗传转化的研究进展。关键词：玉米；受体系统；遗传转化方法 0 前言近年来，随着环境着人口、资源、环境三者之间矛盾的加剧，转基因作物渐渐地进入人们的视野并且显得极为重要。玉米是重要的粮食、饲料，同时还是制药、淀粉、糖浆、油料、酒精工业的主要原料，在我国经济生产中占有非常重要的地位。所以玉米遗传转化的研究备受各国科学家的重视。自1988年Rhodes等首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米遗传转化技术得到了较大的发展[1]。不但许多有价值的基因转入玉米，而且转基因方法也出现了多样化，如基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等。随着转基因技术的发展与完善，更多的优良外源基因将被用于玉米的遗传改良，并且为阐述单子叶植物基因表达调控机理提供了新方法。 1玉米遗传转化受体系统的研究 1．1玉米基因转化受体体系应具备的条件是： 1 高效稳定的再生能力：用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有稳定性和重复性。根据贾士荣等报道认为，用于基因转化的受体系统应具有80%-90%以上的再生频率，并且每块外植体上必须再生丛生芽，其芽数量越多越好，这样才有可能获得较高频率转化。 2 较高的遗传稳定性：植物基因转化是将外源基因导入植物并使之整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状之目的，这就要求植物受体系统接受外源DNA后应不影响其分裂和分化并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传稳定性，尽量减少变异。

植物转基因原理与技术

植物转基因原理与技术植物转基因原理与技术转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程。微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。原理根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同，可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系。植物转基因流程图如下所示。外植体）愈伤组织瞬时表达外源基因植物受体细胞原生质体生殖细胞稳定表达获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定（PCR, Southern blot ,Northern blot,生理指标鉴定等）技术就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术，直接转化技术和种质转化技术。下面分别叙述。一载体转化技术载体转化技术是指通过农杆菌的Ti 或Ri质粒，植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌。它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti（tumour-induced）质粒。它利用Ti质粒控制植物细胞来生产自己独特的“食品”- 冠瘿碱，从而将植物细胞转变成特定营养的安全避难所和工厂。Ti质粒长200-250kb，上面分布着四个区：T-DNA(transferred DNA) ,Vir(virulence gene) ,控制结合转移的区域和与冠瘿碱利用有关的基因区。毒力基因即Vir基因控制着转移DNA 即T-DNA向植物细胞转移，T-DNA是唯一整合进植物基因组的区域，它编码植物激素和冠瘿碱合成酶。T-DNA转化植物的过程如下：植物受伤后释放酚类化合物信号分子被位于细胞膜的VirA蛋白感受，VirA蛋白是受配基刺激自身磷酸化的受体，并将磷酸基团转移给Vir区基因调控蛋白因子VirG。VirG 调控着下游基因的表达来完成T-DNA的切割，包装和转移。天然的Ti质粒因为太大，酶切位点多又诱导产生肿瘤，所以不适合作为载体。经过改造后可以作为基因工程载体，主要是通过破坏或缺失癌基因成为安全载体，太大不适合操作可以通过同源重互换或功能互补来解决。T-DNA整合进植物基因组与其边界序列相关，而与内部序列无关，因此可以将内部控制植物激

植物基因工程

一从现代农业到基因工程 (一)粮食安全现状 1、食物总量供给已成为全球的焦点之一：从2000年开始，全球出现了当年粮食生产量比消费量低的情况，2003年全世界粮食的消费量超过生产量0.93亿吨，世界粮食储备也降低到30年来的最低水平。 1999年以来，我国粮食连续四年减产。1999-2002年，我国粮食总产量累计减少800亿公斤左右。自2000年以来，我国粮食年消费需求大致在4.8-4.9亿吨之间，产需缺口约400亿公斤。 (二)农业发展的一个主要矛盾——科技支撑能力不强农业生产的规模化、专业化和多样化对科技提出了更高的要求，大幅度提高农业劳动生产率需要通过先进适用技术的广泛应用，而目前我国科技进步贡献率只有45%左右，与发达国家的70-80%有很大的差距。一个农业劳动力养活的人口数：美国：70人；日本：约25人；中国：4-5人。农业发展的根本出路是现代农业，而其核心支撑条件是现代农业科技的进步。 (三)现代农业的内涵现代农业是以现代工业和科学技术为基础，重视加强农业基础设施建设，充分汲取中国传统农业的精华，根据国内外市场需要和WTO规则，建立起采用现代科学技术、运用现代工业装备、推行现代管理理念和方法的农业综合体系(引自卢良恕院士)。 (四)建设农业科技创新体系是现代农业的一个根本任务国家级农业科研工作应具有较强的关键性、全局性、基础性、战略性和前瞻性的特点，为加快现代农业建设提供科技支撑。省级有关农业的科研机构应逐步实行联合，重点开展应用研究和开发研究(也可根据需要适当开展应用基础研究)，重视科技成果转化，更好地为发展生产服务(引自卢良恕院士)。到2030年，我国人口的持续增长将要达到高峰期，预计达到16亿人口，解决这个庞大人口的口粮是一个新的挑战。随着人民生活水平的提高，肉蛋奶和水产品的消费不断增加，粮食作为饲料的比重将越来越大，人均粮食占有量的标准应有所提高。 2、食品安全性也成为全球的焦点之一：农业综合措施、现代农业技术尤其是转基因技术的应用，使老百姓对当前食品尤其是转基因食品安全性问题十分关心。 (五)农业科技创新的一个核心内容：良种创新农业科技创新的核心：良种+良法。良种对增产的作用所占的比重越来越大，良种是一个先进技术的集合体。良种创新：植物良种创新、动物良种创新。植物食品占总食品的93%，动物食品占7%，但也间接来自植物食品，所以良种创新的首要任务是植物良种创新。 (六)传统育种面临的挑战以杂交育种为核心的传统育种技术取得了丰硕的成果，目前仍然是主要作物的主要育种手段。目前传统育种技术在改良作物性状方面遇到了一些挑战，如缺乏特别性状的种质资源，育种周期长，难以克服不良性状的连锁或负相关，易受杂交不亲和及杂种不育的限制，远缘物种间不能进行遗物物质交流和性状转移。 (七)基因工程带来的机遇与竞争 20世纪50年代以来，DNA双螺旋模型和基因操纵子学说的提出，以及DNA限制性内切酶的发现，导致了DNA体外重组技术?a?a基因工程技术的发展，推动了分子生物学和基因工程本身在广度和深度方面以空前的速度蓬勃发展，生物技术相关产业和生命科学已经出现划时代的

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。 TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。

植物转基因技术

生物工程的导论论文之植物转基因技术生物1002班郭雅莉 201041006 摘要：目前，转基因技术已经成熟，转基因作物已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。为此，我将对植物转基因技术及其应用、和当代社会发展的概况进行系统阐述，同时对转基因食品的安全性问题进行系统的讨论。关键词：国际状况转基因技术应用安全性问题自1983年美国在世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。然而由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食品”[1]。一、国际植物转基因技术状况简介转基因技术已在多种植物上获得成功，转基因的棉花、大豆、玉米、水稻、烟草、番茄、油菜等重要粮食作物和经济作物已作为商品投入市场。其进入田间实验的种类不断增加，除转基因粮食作物之外，转基因蔬菜、瓜果、牧草、花卉、林木及特用植物数量逐渐增加，基因种类和来源日益丰富，转基因性状日趋多样复杂。在所涉及的转基因方法中，农杆菌介导法占50种，基因枪轰击法24种，DNA直接转移法2种，电击介导法2种，化学介导法1种[5]。已把一些具有实用价值的基因，如抗虫、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗除草剂，抗逆境的基因以及产量、品质、雄性不育、延长保鲜期、生长发育调控等基因分别转

植物基因工程技术及其管理

植物基因工程技术及其管理摘要：植物基因工程是指植物学领域的基因工程，其研究对象是植物。本文介绍了植物基因工程概述，对植物基因工程管理进行了重点阐述，让其能够更好的为我国农业生产服务。关键词：植物基因工程管理植物基因工程技术是利用重组DNA技术，有计划地在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物基因进行改造和重新组合，再插入、整合到受体植物基因组中，使重组基因在受体细胞内表达，从而使受体植物获得新的形状，培育出高产、多抗、优质的新品种。20世纪70年代初建立发展起来的基因工程，经过几十年的不断进步和发展，已在生物学领域起着重要的作用。植物基因工程的研究与应用在世界各地蓬勃发展，被认为是21世纪农业的希望，是新的农业革命的重要组成部分。 1.植物基因工程及技术植物基因工程就是根据人们的目标与设计，在体外对植物遗传物质——基因进行剪切、组合、拼接等，使遗传物质重新组合，然后通过特定载体(质粒、噬菌体、病毒等)转入植物细胞内，并使所需要的基因在细胞中表达，从而创造出人们需要的新的植物类型的技术。基因工程在改良植物性状、品质，增加产量，提高植物抗病、抗虫、抗逆性等各方面具有天然植物无法比拟的优越性，因此其发展空间极为广阔。植物工程基因技术大大拓宽了植物可利用的基因库，按照人们事先计划好的方案引发定向变异己成为现实，给植物育种带来了变革(主要表现在以下几方面：能够打破生殖隔离，使得转基因技术为拓宽植物可利用基因库创造了条件，并提供了新的创造变异的技术手段；用于基因工程育种的基因大多研究得较为清楚，改良植物的目的性状明确，选择手段有效，使引发植物产生定向变异和进行定向选择成为可能；通过改良植物的一些关键性状，会使原推广品种在很大程度上得到提高，不但可以缩短育种年限，而且可能在不同的生态区取得全面突破；随着对基因工程认识的不断深入，新基因的克隆和转基因技术手段的完善，对多个基因进行定向操作也将成为可能，这在常规育种中是难已想象的，而且有可能引发新的“绿色革命”。 2.基因工程植物可能带来的危害及产生机制人们也逐渐认识到，由于目前的科学技术水平还不能精确地预测植物基因工程的所有表现效应，植物基因工程的安全性问题已引起人们的高度重视。 2.1基因工程植物可能带来的危害