园艺植物遗传转化
第九章 园艺植物遗传转化载体的构建
• Ubiquitin启动子
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
• 二、Ti中间表达载体的构建 • (二)嵌合基因的构建
• 嵌合基因: 来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因连接在
一起而构成的基因.
• 完整的嵌合基因: 完整,正确的可读框,能正确表达,3′端的终止信 号. “植物特异性启动子+目的基因+终止子”、 “植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和 “植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。
一个理想的载体应该具备以下几个 特点：
• 有一个或多个复制起点，可在一种生物体 中自主复制 • 至少有一个多克隆位点，以供外源DNA插入 • 至少有一个遗传标记基因，以指示重组DNA 分子是否进入宿主细胞 • 具有较小的分子质量和较高的拷贝数 • 无毒性
基因工程中所用载体的分类 • 按来源分类
• 细菌质粒 • 噬菌体类 • 酵母质粒 • 病毒DNA衍生物
Ti质粒介导基因转化的原理
• 1. 植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α羟基乙酰丁香酮等)。
• 2. 酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因 (vir)表达:当根癌农杆菌接触 到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经 VIR A蛋白传递给VIR G， VIR G激活其它vir 基因( virB、 virC、 vir D、virE )表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。
（2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌 产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、 VirB、 VirC、 Vir D、VirE、 VirG、 VirH7个操纵子共 24个基因。
植物遗传转化研究进展
植物遗传转化研究进展一、植物遗传转化技术的发展目前，基因枪法是最常用的植物遗传转化技术之一、该方法通过将特定基因或外源DNA片段载入微粒或金属微粒表面，并利用高能量加速器，将其“枪射”入植物细胞中。
这种方法具有转化效率高、转基因植物种类广等优点。
另一个常用的植物遗传转化技术是农杆菌介导的转化法。
该方法通过注射农杆菌悬浮液进入植物受体细胞中，利用特定的农杆菌转移DNA到植物基因组中。
农杆菌介导的转化法具有转化效率高、适用范围广的特点。
二、植物遗传转化应用领域在农业领域，植物遗传转化技术可以用于改良作物的抗性能力，提高作物产量和品质，并改善作物的耐盐碱、耐旱、抗虫等性状。
例如，通过转入抗虫基因，可以使作物具备抵抗虫害的能力，从而减少农药的使用，达到生态环境保护的目的。
同时，植物遗传转化技术也可以用于改良作物的适应能力，使其能够在恶劣环境下存活和生长。
在医药领域，植物遗传转化技术可以用于生产重要药物和疫苗。
通过将相关基因导入植物中，利用植物生长发育的能力，可以大量生产特定蛋白质，从而制取药物和疫苗。
这种方法不仅生产成本低，还减少了对动物的依赖，有利于提高疫苗的安全性。
在环境领域，植物遗传转化技术可以用于修复受到污染的土壤和水体。
通过将相关基因导入植物中，使其能够吸收和转化毒性物质，从而达到治理污染的目的。
这种方法被广泛应用于石油污染地区、重金属污染地区等。
三、植物遗传转化的研究进展随着植物遗传转化技术的发展，人们不断探索新的方法和途径，以提高转化效率和稳定性。
此外，人们也在探索非转基因的植物遗传改良方法。
在非转基因改良中，人们通过引入RNA干扰技术、微量RNA技术等方法，通过调控内源基因的表达来改变植物的性状。
这种方法避免了外源基因的导入，从而减少了对转基因植物的争议。
总的来说，植物遗传转化技术在农业、医药和环境等领域有着广泛的应用和研究。
随着科学技术的不断进步，植物遗传转化技术将为人类创造更多的可能性和机会。
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。
一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。
常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。
1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。
该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。
首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。
在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。
2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。
将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。
在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。
3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。
通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。
二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。
常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。
1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。
它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。
在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。
通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。
我国科学家创立高效便捷植物遗传转化新方法
８２．
５ ０ ０ ０ ｋ ｇ 。圃
我国科学家创立高效便捷植物遗传转化新方法
我国科学家通过利用磁性纳米粒子作为基 因载体 ，创立 了一种高通量、操作便捷和用途广泛的植物遗 传转化新方法，推动纳米载体基因输送与遗传介导系统研究并取得 了重要进展，开辟 了纳米生物技术研究 的新方向。相关研究成果于２ ０ １ ７ 年１ １ 月２ ７ Ｅ ／ 在线发表在权威学术期刊 自然一植物 （ Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｓ ） 上。
新 优 品年 中
Ｖｅ ｇ ｅ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｓ ２ ０ １ ８ ． １
经过５ ～６ 代 的选 择 达到 提 纯 目标 。 在 提 纯 过 程 中 ，采 用 单 株 人 工 自交 授 粉 留
利用 人 工 网纱 、塑料 大 棚 等 隔离 ，但 制 种 成本 会
种 法 ，具体方法 ：在授粉 的前 １ 天下午用 小夹子 将 待 放 的雄 花 和雌 花 夹 上 ，第 ２ 天 早 晨 将 雄 花 摘
花 。注意防止病虫害 的发生 ，主要注意防治细菌
性 角斑 病 和 霜前茬作物不要种植瓜类 ，最好是谷类作物。 为了保持种性 ，根据季节特性 ，春季品种应在春 季 繁殖 留种 ，夏季品种应在夏季繁殖 留种。冀东 地 区 每年 的４ —７ 月 ，气 温适 合且 雨 水 少 ，非 常适 合 黄瓜露地繁种。
克服 了传统转基 因方法组织再生培养和寄主适应性等方面的瓶颈 问题 ，可以提高遗传转化效率 ，缩短转 基 因植物培育周期，实现高通量与多基 因协同并转化 ，适用范围与用途非常广泛 ，对于加速转基 因生物 新品种培育具有重要意义，在作物遗传学、合成生物学和生物反应器等领域也具有广泛应用前景。图
和 雌 花 夹住 ，第 ２ 天 早 上 人 工 授 粉 。原 种 和生 产 种 一 般 利 用 远 距 离 自然 隔 离 ，例 如 ，选 择 有 村 庄 、河 流 、树 林 等 自然地 形 的生 产 基 地 繁 种 ，或
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤
植物遗传转化是指通过人为手段，将外来基因导入植物细胞内，使其产生新的遗传特征。
植物遗传转化的步骤主要包括以下几个方面： 1. 基因载体构建：基因载体是将所需基因导入植物细胞内的载体，包括质粒、病毒、人工染色体等。
构建基因载体需要选择适当的载体和适合的启动子、终止子、选择标记等元件。
2. 转化体系建立：植物遗传转化需要建立一套合适的转化体系，包括培养基的配制、细胞培养和再生体系等。
转化体系的搭建需要考虑到不同物种、基因载体和转化方法的特点。
3. 基因导入：基因导入可以通过直接基因转移、基因炮击、农
杆菌介导转化等手段进行。
其中，农杆菌介导转化是最常用的基因导入方法。
在基因导入过程中，可以使用选择标记来筛选生产基因转化植株。
4. 识别和筛选：基因转化后的植物细胞需要进行识别和筛选。
常用的识别方法包括PCR检测、Southern杂交、Northern杂交等。
筛选方法可以通过细菌耐草酸和遗传标记等手段进行。
5. 品系选育：经过基因转化的植物需要进行品系选育，通过选
择有利的基因型和表型，后代将具有更好的遗传特征。
品系选育需要进行多代重复筛选，最终得到具有稳定表达和优良性状的转化植株。
6. 安全评价：基因转化后的植物需要进行安全评价，包括对植
物生长性状、代谢产物、土壤微生物等方面的评价。
安全评价是确保基因转化植物的生态安全性和食品安全性的重要环节。
植物遗传转化中存在的问题与对策
植物遗传转化中存在的问题与对策大家好，今天我们来聊聊植物遗传转化这个话题。
我们要明确什么是植物遗传转化。
简单来说，就是把一个生物体的基因转移到另一个生物体上，让后者具有前者的某些特性。
这个过程在农业、医学等领域都有广泛的应用，比如让我们吃到更多颜色鲜艳的蔬菜水果，治疗一些遗传性疾病等。
但是，植物遗传转化的过程中也存在一些问题，我们接下来就来看看这些问题以及应对措施。
1.1 植物遗传转化成功率低我们来说说植物遗传转化成功率低的问题。
有时候，我们希望把一个生物体的某个基因转移到另一个生物体上，但是实际操作过程中，这个基因可能并没有成功地转移到目标生物体上。
这就导致了遗传转化的成功率比较低。
这个问题的原因有很多，比如基因之间的相互作用、载体的选择等等。
那么，我们应该如何提高遗传转化的成功率呢？1.2 提高基因转移效率要提高遗传转化的成功率，我们需要从提高基因转移效率入手。
我们可以尝试使用不同的载体来进行基因转移。
载体就像是一个“搬运工”，帮助基因顺利地从一个生物体转移到另一个生物体上。
目前市面上有很多种载体，比如细菌质粒、病毒载体等。
我们可以根据实际需求选择合适的载体。
我们还可以尝试优化载体的设计，比如增加载体的大小、改变载体的形状等，以提高基因转移效率。
2.1 植物生长环境对遗传转化的影响接下来，我们来说说植物生长环境对遗传转化的影响。
有时候，我们在实验室里进行遗传转化实验的时候，发现同样的实验在不同的植物上取得了不同的结果。
这是因为植物生长环境对遗传转化的过程有一定的影响。
比如，光照、温度、土壤等因素都可能影响到基因的表达和遗传转化的效果。
那么，我们应该如何应对这种问题呢？2.2 优化植物生长条件为了解决植物生长环境对遗传转化的影响，我们需要优化植物生长条件。
我们可以尝试在实验室里模拟出各种生长条件，比如不同光照强度、不同温度等，然后观察这些条件下基因转移的效果。
通过这种方法，我们可以找到最适合某种基因转移的条件。
园艺植物遗传转化载体的构建
03
终止子是位于目的基因 下游的一段DNA序列， 能够终止目的基因的转
录。
在园艺植物遗传转化中， 常用的终止子有
CaMV35S终止子和花椰 菜花叶病毒（CaMV）
35S终止子等。
终止子的选择对于目的 基因的表达水平和转录
效率具有重要影响。
复制子
01
复制子是用于在转化细胞中复制目的基因的元件， 通常来源于病毒或质粒。
02
在园艺植物遗传转化中，常用的复制子有来自SV40 的复制子和来自pBR322质粒的复制子等。
03
复制子的选择对于目的基因的拷贝数和表达水平具 有重要影响，同时也应考虑安全性因素。
03
园艺植物遗传转化载体的构建方法
质粒DNA的制备
提取质粒DNA
从宿主细胞中提取质粒DNA是构 建转化载体的第一步，常用的方 法有碱裂解法、煮沸法和高盐沉 淀法等。
纯化质粒DNA
提取的质粒DNA需要进行纯化， 去除杂质和核酸酶，以保证后续 酶切和连接的顺利进行。
检测质粒DNA质
量
通过电泳和紫外分光光度计等方 法检测质粒DNA的质量，确保其 纯度和浓度满足后续实验要求。
限制性酶切和连接
选择限制性内切酶
01
根据目的基因和载体的大小选择合适的限制性内切酶，以确保
酶切位点的准确性和后续连接的效率。
限制性酶切
02
将质粒DNA和目的基因分别进行限制性酶切，获得具有相同黏
性末端的片段。
连接反应
03
将酶切后的目的基因和载体进行连接，形成转化子。连接反应
的条件和时间对转化效率有重要影响。
转化子的筛选与鉴定
转化子筛选
将连接产物转化到受体细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定等方法 筛选阳性转化子。
生物技术 园艺植物基因工程步骤
生物技术园艺植物基因工程步骤
园艺植物基因工程是指通过生物技术手段对园艺植物的基因进行改变或调控，以获得所需的遗传特性。
其步骤主要包括以下几个方面：
1. 目标设定：确定要改变的遗传特性和目标基因，例如提高植物的产量、抗性、品质等。
2. 基因克隆：从目标植物中提取DNA，并使用分子生物学技术将目标基因扩增、纯化，以获得目标基因片段。
3. 基因构建：将目标基因片段插入植物基因工程载体（例如农杆菌载体），并利用适当的限制性内切酶将其与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
4. 转化方式选择：选择适合的转化方法将重组DNA导入目标植物细胞，主要有农杆菌介导转化、生物弹射法或冷冻融合法等。
5. 遗传转化：将经过构建的重组DNA导入植物细胞，使目标基因插入植物染色体，形成转基因植物。
6. 试管繁殖：对转基因植物进行离体培养，通过细胞分裂和组织增殖等技术，大规模繁殖转基因植物。
7. 筛选和鉴定：利用分子生物学和生化分析等技术对转基因植物进行鉴定和筛选，确认目标基因的存在和表达情况。
8. 田间试验和推广：在试验田或实际种植场进行转基因植物的田间试验，评估其生长发育、产量、品质和抗性等性状，同时进行安全性评估和环境风险评估。
9. 商业化推广：通过权威部门的安全评估和监管审核，将合格的转基因植物品种进行商业化推广，使其广泛应用于园艺产业。
需要注意的是，园艺植物基因工程步骤可能会因具体目标和植物而有所差异，以上步骤仅供参考。
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
3，具有稳定的外植体来源 转基因研究的工作效率不高，同一实验内
容往往需要多次重复进行。 只有稳定的外植体来源，才能够方便科学研
究的进行，并从材料的源头上提高实验结果的 重现性，便于对实验结果的总结。
由种子萌发得到的子叶、胚轴；以及无菌培 养的小苗叶片，都是比较理想的材料。
抗病虫育种、抗逆境育种、品质改良
功能基因组学
（functional genomics）
基因加标(gene tagging) 基因敲除(gene knock-out) 候选克隆的功能互补试验
植物代谢工程
( plant metabolic engineering )
利用转特殊基因的植物作为生物反应器 (bioreactor)工厂化生产工业或医药用品
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第一节 植物遗传转化的基础
3，植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不 涉及非目标累赘基因，因而更具有针对性，可加快育 种进程；
可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制， 扩大可利用的资源库（动物、植物、微生物、人工种质；
5，导入外源基因的方法
目前应用最多的是基因枪法和农杆菌介导法 （具体参考实验指导书）
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了
共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
4，抗生素敏感性 4.1，对于抑制农杆菌的抗生素的敏感性
在利用农杆菌转化植物材料时，需要在转 化事件完成后采用抗生素抑制农杆菌的生长。 抗生素对植物材料也可能产生伤害作用，因此， 要求受体材料能够比农杆菌耐受更高浓度的某 种抗生素的毒害作用。
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植物口服疫苗 （edible vaccines）
4
植物口服疫苗
转基因植物口服疫苗，是将病原微生物 的抗原编码基因导入到植物细胞内，然 后诱导细胞再生得到转基因植物。人类 食用这种转基因植物的产品，因为其中 包含有抗原基因表达的产物，就可以激 发黏膜免疫，使机体产生特异性抗病能 力。
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
4，抗生素敏感性 4.2，对于作为筛选剂的抗生素的敏感性
通过转化处理，接受外源基因的细胞总是少数。这些细 胞还可能因为转化而受到某些损伤而在群体中处于劣势。
为了使这些转化的细胞能够在与非转化细胞的竞争中取胜， 通常的策略是在转化外源基因的同时也转化了一种能够解 除某种抗生素的毒性的基因。将该种抗生素（筛选剂）加 入到培养基里，就可以使对该种抗生素敏感的没有转化的 细胞受到抑制，使转化的细胞得到相对的选择。
第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
2，较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保持
物种原有性状不变的基础上增加某一（些）性 状或对某一特定性状进行改良，因此，受体材 料的遗传稳定性十分重要。
原始自然的材料（例如叶片、子叶、胚轴等） 比经过脱分化离体培养的材料在保持遗传的稳 定性方面具有优点。
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
6，和研究的目的相适应
单纯以理论研究或方法的建立为目 的的实验在转化受体的选材上受到的限 制相对要小一些；有应用目的的研究则 除了受到以上各方面的限制外，还需要 采用优良品种作为材料，通过遗传转化 改良成为更加优秀的新品种，在产业上 直接推广应用。
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
1，高效稳定的再生能力
通过基因枪或农杆菌转化的转化率都还比 较低，转化过程还可能对细胞造成损伤，导致 植株再生能力的下降。
再生能力的高低直接影响了遗传转化的工作 效率；高的转化效率建立在高的受体材料再生 能力的基础上。
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以转基因植物为主体的植物化工厂具有高效、低污染、
可再生的优点。
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第一节 植物遗传转化的基础
4，植物遗传转化的技术流程
取得目的基因→目的基因的修饰→目的基因 扩增与回收→载体的构建与组装→目的基因导 入受体生物细胞→转基因体的筛选与鉴定→获 得转基因体
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第一节 植物遗传转化的基础
2，基因枪法转化的特点：
不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞 作为靶材料。
操作简便。
常常是多拷贝转化和整合，因而易造成转基 因沉默和转基因后代目的基因分离复杂化。
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第二节 转化的受体系统
植物基因转化的受体是指直接接受基因 转化的细胞（包括原生质体）、组织或 器官；
转化受体系统除了受体材料外，还包括 能够使受体在接受转化操作后，其中的 非转化细胞受到抑制和淘汰、转化细胞 得到选择和受到定向诱导，发育再生成 为完整植株的一系列技术过程。
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园艺植物遗传转化
植物遗传转化的基础 植物基因转化受体系统 转化体的筛选与鉴定
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第一节 植物遗传转化的基础
1，植物遗传转化的定义
外源遗传物质进入植物细胞，与染色体整合 并通过减数分裂进行遗传。
园艺植物遗传转化
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2，植物遗传转化技术的应用领域
作物育种 ( plant breeding )
园艺植物遗传转化
植物遗传转化是遗传工程的主要内容，遗传工 程包括基因工程和细胞工程两部分。
基因工程包括目的基因的克隆，转化载体的构 建和目的基因的表达；细胞工程在遗传工程中 的作用是提供外源基因的受体材料和创造使目 的基因能够表达的条件。
外源基因的转化是连接基因工程和细胞工程的 技术环节。
细胞工程是连接基因工程和生产应用的桥梁。
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第二节 转化的受体系统
一、转化受体的条件
5，农杆菌敏感性 对于农杆菌介导的基因转化来说，需要受
体材料对农杆菌敏感，因为只有对农杆菌敏感 的材料才能够接受农杆菌的转化。一般认为， 大多数双子叶植物对农杆菌敏感而单子叶植物 不敏感。
农杆菌有不同的菌株，同一材料对不同菌株 的敏感程度可能存在不同；目前，还可以采用 化学试剂（乙酰丁香酮）来弥补敏感性的不足。