农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤(精)
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备在科学的世界里，农杆菌这家伙可是个大明星，尤其是在植物基因工程中，简直就像是超级英雄一样的存在。
说到农杆菌，它是个很有趣的小家伙，特别是在我们想把新基因转移到植物里的时候，它的表现真是让人惊叹。
今天就来聊聊怎么准备感受态细胞，听起来有点高大上，其实就是让植物细胞准备好接受外来的基因，像小朋友期待新玩具一样，兴奋得不得了。
要准备的就是农杆菌的培养。
想象一下，咱们要给这些小家伙开个派对，当然要先让它们有个好环境。
选个合适的培养基，像是给它们铺一张舒适的床。
然后，温度、pH值、氧气这些条件也得一丝不苟，不能马虎。
温度太高，农杆菌可受不了，像人一样，热得直冒汗；温度太低，它们又会懒洋洋的，没精神。
要是培养基里的营养不够，嘿，那简直就是饿肚子的小朋友，没啥干劲。
就得让这些小家伙进入生长期，哈哈，听起来像在养宠物。
等它们长到合适的密度，咱们就准备好收割成果啦。
这时候，得小心翼翼地把它们从培养基里取出来，别把它们给弄伤了，像捧着刚出生的小宝宝一样。
取出的细胞要经过洗涤，洗去多余的培养基，确保它们干净得像新洗的衣服。
用生理盐水轻轻地重悬这些细胞，调成合适的浓度，让它们准备好迎接“客人”。
这里有个小窍门，嘿嘿，增加细胞的感受性。
可以用一些特殊的化合物，比如PEG，这玩意儿就像催化剂，能帮助细胞更好地接受外来的DNA。
想象一下，像是给小朋友加了点魔法，立马变得更加活泼，更有好奇心。
然后，得把想要转移的DNA和这些感受态细胞混合。
这个过程就像搭积木，得小心翼翼，别让它们散架。
把这个混合物在特定的条件下静置一段时间，让细胞慢慢适应，就像在等待一场盛大的聚会。
期间，要保持适宜的温度和环境，让它们尽情享受这个过程。
就要进行转化了。
这一步就像是给这些细胞送去了新玩具，兴奋得不得了。
把细胞和DNA一起放到农杆菌中，轻轻搅拌，别太猛，怕把小家伙们给搅晕了。
静置一段时间后，它们就会开始接受这些新基因，像在参加一场欢迎会一样。
感受态细胞的制备的实验步骤
感受态细胞的制备的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。
感受态细胞的制备步骤和原理
感受态细胞的制备步骤和原理实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。
制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。
本次实验的目的就是增加质粒的数量。
同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。
实验原理及过程实验步骤1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37℃，180rpm 培养过夜。
[ 让菌复苏，进入对数期的早中期。
此时更容易制得感受态细胞。
]2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37℃250rpm大约2.5 小时。
[ 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。
]3 取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。
（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）[ 使细菌的生长停止，代谢减慢。
因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。
]4 菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2 中，轻吹，4℃ 30min ，4000rpm 离心5min 弃上清。
[ 细菌处于0 度，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]5 菌体重悬于1mL 100mmol/L 冰冷的CaCl2 中，轻吹，用于转化。
[ 除去所有的LB 以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。
防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]6 取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a 质粒，冰浴30 min 受体菌：感受态细胞100uL ，加入 2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2 溶液100uL，加入 2 uL 阴性对照[ 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a 质粒未被污染。
农杆菌感受态制备
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版本一 1.1 农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的 EHA105 于含 50μg/ml 链霉素平板划线，28℃培养。 1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM 液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养 12-16 hr。 1.1.3. 取 2ml 菌液转接于 100ml YM 液体培养基中，28℃220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。 1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心 5min,去上清液。 1.1.5. 加入 10ml 预冷的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置 20min。4℃5000rpm 离心 5min，去上清。 1.1.6. 加入 4ml 预冷的含 15%甘油的 0.1M 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮。 1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌 Eppendorf 管中，每管 200μl 冻存于-70℃。 1.2. 双元载体转化农杆菌 EHA105 取 1μg 左右的质粒 DNA 加入到 200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴 30min，-70℃放 置 10min 。再在 37℃水浴 5min 或 42℃水浴 1min，接着冰浴 2min，加入 800mlYM 液体培养 基 28℃，175rpm 摇培 3hr 后涂在含 50μg/ml Kanamycin 的 YM 平板上。28℃培养到形成单 菌落。 其中 YM 可以用 LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。 版本二 普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于 2ml YEP 培养基（含 Rif20mg/ml）中 28℃过夜活化。 2. 取 2ml 过夜菌液接种于 50ml YEP 培养基中 28℃生长至 OD600 约等于 0.5 左右（4hr）。 3. 5k rpm 离心 5 分钟。 4. 在 10ml 0.15M NaCl 中悬浮细胞。 5. 5 krpm 离心 5 分钟，悬浮细胞于 20ml 冰预冷的 CaCl2。 如不是马上使用，可以将之按 200ul 分装储存于-80℃待用。 6. 加 1ug DNA 于 200ul 感受态细胞中，冰上放置 30 分钟。 7. 液氮中冷冻 1 分钟。 8. 37℃水浴溶化细胞。 9. 加 1ml YEP 培养基，28℃摇床培养 2-4hr（低速）。 10. 离心 1 分钟，悬浮细胞在 100ul YEP 培养基中。 11. 涂板，28℃培养 2-3 天。
农杆菌的培养与感受态制备
农杆菌的培养与感受态制备农杆菌感受态的制备与转化实验室根癌农杆菌感受态的制备：1.取保存于-70°LBA4404菌株在YEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或平板活化，挑取单菌落接种于5mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或YEP(含50mg/l利福平)液体培养基中，28°C、200rpm培养24-28h。
2.取2ml菌液接种至50mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或利福平)中，28°C、200rpm培养至OD600≈0.5左右。
3.菌液冰浴30min后，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。
4.弃上清，用10ml0.15mol/lNacl重悬菌体，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。
5.弃上清，用2ml20mmol/lCacl2重悬菌体，加入1ml60%无菌甘油(使其终浓度为20%），每管100μl分装，液氮冻存，-70°C保存。
重组质粒电转入农杆菌中：1.从大肠杆菌中提取重组质粒，将5μl重组质粒加入农杆菌感受态中，至于冰上30min。
2.将混合物加入电击杯中，选择“Agr”模式（电压2.2kv，时间4.9m）电击，加入800μlYEB培养基，28°C、200rpm振荡培养3-5h，8000rpm离心30S（实际操作中不离心，吸取菌液50、100、150ul等多做几个梯度，用无菌水稀释至180ul），弃上清，涂布于YEB平板（含农杆菌和质粒所带抗生素，如Kan和利福平）。
3.28°C恒温箱中倒置培养48h（24h以上）。
4.从农杆菌中提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；扩目的片段并测序验证。
5.转化烟草等实验材料。
YEB培养基：1.0.5%（w/v）蔗糖，0.1%（w/v）细菌用酵母提取物，1%（w/v）细菌用胰蛋白胨，0.05%（w/v）MgSO4·7H2O，调节pH7.0，121°C灭菌15min。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备（以GV3101菌株为例）：1.在新铺制的加有20 mg/L Gen（庆大霉素）、50 mg/L Rif的YEB固体培养基上，用接种环或灭菌牙签“平板划线法”通过分区划线稀释分离得到农杆菌GV3101菌株的单克隆菌落。
2.挑选一个单克隆菌落，接种到5 mL新鲜的加有20 mg/L Gen、50 mg/L Rif的YEB液体培养基中，置摇床上28℃振荡培养过夜。
3.将过夜摇浓的GV3101菌液按1: 100比例接种到50 mL新鲜YEB液体培养基中，置28℃摇床，200 r/min振荡培养至OD600为0.5左右，将菌液转移至50 mL离心管，冰浴30 min。
4.集菌：将菌液置于4℃预冷的离心机中离心，4,000 r/min，10 min。
5.重悬：弃上清，加入10 mL预冷的0.15 M NaCl溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，4,000 r/min，4℃离心10 min。
6.重悬：弃上清，加入1 mL预冷的20 mM CaC12溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，分装至预冷的1.5 mL无菌离心管中，液氮速冻后，-80℃保存备用。
农杆菌感受态细胞的转化（冻融法）：将农杆菌感受态细胞从-80℃取出后置冰上自然解冻，在超净台中用无菌枪头吸取2 μL质粒加入到感受态细胞中，轻轻吹打混匀后于冰上静置30 min，再经液氮速冻2 min，37℃水浴热激5 min，在超净台内加入900 μL YEB液体培养基，置28℃摇床100 r/min慢速震荡复苏培养4-6 h。
复苏后的菌液离心，弃去约800灿上清，余下上清将菌体重悬起，均匀涂布到抗性筛选YEB固体培养基上，培养平板倒置于280C恒温培养箱内避光培养36—48 h。
菌落PCR初步鉴定阳性克隆：用灭菌牙签蘸一点菌落作为模板材料将其溶解在PCR反应体系中，PCR程序中的预变性时间相应延长，使细菌细胞壁裂解释放出核质。
通过比较电泳条带的大小，初步确定是否为阳性克隆。
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤
一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
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一、目的及要求
了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理
在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂
仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株
试剂：
YEB 液体培养基（1升）：酵母提取物1g ，牛肉膏5g ，蛋白胨5g ，蔗糖
5g ，
MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；
链霉素（Sm ）储液：125mg/ml
0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤
1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB 液体培养基（含Sm
125mg/l）中，28°C 振荡培养过夜；
2. 取过夜培养菌液0.5ml 接种于50mlYEB(Sm 125mg/l液体培养基中，28°C 振荡培养至OD600为0.5；
3. 5000rpm, 离心5min ；
4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min ；
5. 弃上清，置于冰上，加入1ml 预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml ，液氮中速冻1 分钟，置70°C 保存备用。