CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化
大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化准备工作：1、LB琼脂平板若干。
2、50mL离心管若干，加满超纯水后于121℃20分钟灭菌备用。
3、含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶若干，121℃20分钟灭菌烘干。
4、1.5mL离心管若干，121℃20分钟灭菌烘干。
5、22﹪灭菌甘油溶液：22mL甘油加入78mL超纯水，121℃20分钟灭菌，保存于4℃。
试剂：1、100mL1mol/LCaCl2溶液：14.7gCaCl2.2H2O用超纯水配制成100mL贮存液，灭菌备用，保存于4℃冰箱。
2、100mL0.1mol/LCaCl2溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL灭菌超纯水混匀，保存于4℃冰箱。
3、100mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL22﹪的灭菌甘油溶液，混匀，保存于4℃冰箱。
感受态细胞制备：1、晚上从－70℃冰箱活化大肠杆菌（如DH5α或JM109），划LB平板，37℃培养过夜。
2、晚上从培养平板上挑取单菌落接种到一支3mLLB液体培养基试管，37℃培养过夜。
3、早上按1：100比例将过夜培养菌液接种到含有50mLLB液体培养基的250mL 三角瓶中，200rpm，37℃培养1-2hr左右，测OD600到0.2-0.3时，转到50mL离心管，冰浴10分钟左右。
4、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。
5、去上清，用0.1mol/L10mLCaCl2溶液重悬菌体，水浴20分钟左右。
6、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。
7、去上清，将收集的菌体用1mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液重悬，分装成100μl每个离心管，与－70℃保存。
8、必要时以浓度已知的标准质粒转化制备的感受态细胞以估计效率。
转化：1、从－70℃冰箱取出含有感受态细胞的离心管，在超净台上冰浴，待其融化后，加入连接产物或对照质粒，冰浴30分钟。
2、将离心管从冰浴取出并迅速转到42℃水浴热激90s，然后转冰浴2分钟。
CaCl2法制备感受态细胞
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
感受态细胞的制备及转化
实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。
通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。
细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。
将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。
通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。
三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。
2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。
2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。
3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。
应准备两个培养物。
4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。
OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。
所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。
5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。
6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。
7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
感受态细胞的制备的实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。
附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞
实验5 细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。
实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。
菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内保护剂。
目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。
复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。
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CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
⏹1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液
体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)；
⏹ 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振
荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中；
⏹ 3、培养物于冰上放置20min；
⏹ 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的
0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；
⏹5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的
0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；
⏹ 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µL冰冷的
0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感
受态细胞悬液；
⏹ 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置
12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右
高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，
可保存半年至一年。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中
37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振
荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上
操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动
打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动
打匀，使细胞重新悬浮；
9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超
低温冷冻贮存备用（－70℃）。
注意事项
1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使
用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；
2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的
推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的
活菌数随时间延长而减少造成的）；
4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子
（如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；
5 ．所使用的器皿必须干净。
迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能
大大降低细菌的转化效率；
6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；
7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；。