(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备方法
大肠杆菌感受态细胞的制备步骤：
1．划线，出单菌落。
2．挑取单菌落，接种于5ml psI液体培养基中（试管），37℃振荡培养12h左右，直至对数生长后期。
3．转接，取菌悬液以1%的比例接种于100ml psI液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600=0.5左右。
4．OD值达到后，取下摇瓶冰上放置20min。
5．将培养液转入50ml离心管中，4℃，5000rpm，离心10min。
6．弃上清，用0.4倍体积冰冷的溶液I轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下5000rpm 离心10min。
7．弃上清，加入0.04倍体积的溶液II，轻轻悬浮细胞，冰上放置15min，即成感受态细胞悬液。
8．感受态细胞分装成100μl的小份，贮存于-80℃。
溶液与试剂
1.psI培养基配制：
酵母提取物5g，胰蛋白胨20g，MgSO4 7H2O 5g，定容至1000ml，用KOH调pH=7.6 2.溶液I配制：
将5g RbCl，1M KAc 12.3ml，1M CaCl2 4.1ml，1M MnCl2 20.5ml，61.5ml甘油混匀，用0.1M乙酸调pH=5.8，加水定容至410ml。
过滤除菌。
3.溶液II配制：
将1M Mops 1.5ml，1M CaCl2 11.25ml，1M RbCl 1.5ml，22.5ml甘油混合均匀后，1M KOH 调pH=6.5，加超纯水定容至150ml，过滤除菌。
(完整版)大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab)
(Jin Quan-Wen Lab at XMU)
一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：
第Hale Waihona Puke 天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落， 接种入盛有 5ml LB 液体培养基的培养管中， 可以准备两管。 37 C，220rpm，培养过夜（ 14-16 个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（ 250-500ml）和几个 50ml 离心管，以备第二天离心收 集细菌用。
* Optimal efficiency is ca. 1X10 8 cfu/ gμDNA for general cloning. ** For library transformation, efficiency with ca. 1X10 9 cfu/ gμDNA is required.
感受态细胞制备简要流程： 收集细胞 冰水冲洗细胞 2 次 10% 甘油冲洗细胞 1 次 重悬细胞在 10% 甘油 分装
5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约 中。 4 C，4000rpm，离心 15 分钟。
500ml 冰水
6．弃上清，往离心管中加入少量 10%甘油 (灭菌，预冷 )，重悬菌体，再加 10% 甘油至终体积约为 20ml。 4 C, 4000rpm, 离心 10min 。
7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散 !），加入 2ml 10%甘油 (灭菌，预冷 )重悬 浮细胞。
二、电转化 [连接产物、纯化质粒或质粒 ]： 1．从 -80 C 冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。 2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。 3．将解冻的感受态细胞按照 40～ 100ul/管转移至预冷的 1.5ml 的离心管中，小
心混匀，冰上放置。 4．取 1-2 μl 纯化的质粒或克隆连接产物于 1.5ml 的离心管中，冰上放置 10min。
大肠杆菌感受态细胞得制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目得1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。
二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。
感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。
细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。
本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子得感受态细胞。
在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。
而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。
主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有:(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;(3)适量得溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。
证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞得转化理论尚未有统一结论,但就是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株得转化结果,认为:近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在p H6、0 得100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来得水平。
CaCl2法大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
感受态细胞(Competent cells):
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3~4ml LB液体培养中，37℃振荡培养~12h左右，直至对数生长期。
将该菌悬液以1:100～1:50转接于3 x 100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
（2）取培养液50ml转入50ml离心管中，在冰上冷却30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液，用15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10Min；（4）0～4℃，4000r／min离心10min；
（5）弃去上清液，加入~15ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。
冰浴10 min 后，0～4℃，4000r／min离心10min；
（6）弃去上清液，加入2ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
（7）加入占总体积10％左右高压灭菌过的甘油，混匀后以200 l为单位分装于0.5ml EP 管中，置于-80℃保存。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
实验6_大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
试剂 1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl
10
琼脂（1.5%） 15g （注：LB培养液不加琼脂）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂， 待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。 121℃湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中
pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码 信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主 细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶 （ β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物XGal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的 多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带 有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如 用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重 组质粒的细菌形成白色菌落。
4000rpm离心5分钟。
2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分）。
3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞 完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下4000rpm离心5分钟。
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电泳 ,约 1h 后 ,loading buffer 条带跑到底 ,便可停止 . ⑸考马斯亮蓝染色 ① 将电泳后的 PAGE 胶取下放入容器中 ,加入 50ml 双蒸水或去离子 水 ,加热至沸腾后停止 ,
继续在脱色摇床上摇动 5min, 弃去水溶液 .
② 加上染色液 ,以浸没胶面为准 ,加热沸腾后保持状态 30-60s, 停止加热后继续在脱色摇床
了暂时性的改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞 （ Compenent cells ）。进入
受体细胞的 DNA 分子通过复制、 表达实现遗传信息的转移， 使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（
Transformant ，即带有异
源 DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有
但在人工构建的质粒载
体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞
的接合转移。 如需将质粒载体转移进受体细菌， 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态， 以
摄取外源 DNA 。
转化（ Transformation ）是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种
上摇动 10min, 弃去染色液 .
③ 加入约 50ml 的水 , 再加热至沸腾后保持沸腾状态
30-60s, 停止加热后在摇床上要
5-10min, 换水可完成脱色 .
④ 若要得到无背景的染色胶 ,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜 .
镍柱。 用不同浓度的咪唑洗脱。 因为咪唑和组氨酸都带正电， 可在咪唑逐渐加大浓度的条件 下洗脱目的蛋白。 protocol 里有啊。
Tris- HCl 1M PH8.0 1000 ⑵ 上样
μ l,NaCl 4M 1000
μ l,Brij 20
μ l,DTT 3 μ l, H2O 18ml.
加 2ml 上清到 Ni 柱中 ,并用 2ml AT buffer 冲洗 .(注意缓慢滴加 )
⑶ 洗脱样品
加上 1ml 的 salt washing buffer 冲洗 ,其配方是 AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100 μl.
(3)30% 甘油： 30mL 甘油溶于 100mL 蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1) 超净工作台 (2) 冷冻离心机 (3) 恒温摇床 (4) － 70 ℃冰箱 (5)10mL 移液管 (6) 吸耳球 (7)1mL 、200 μＬ移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL 离心管
分子蛋白质不能进入孔内而径直流出 ,因此不同大小的蛋白质得以分离 .6、超速离心： 利用物 质密度的不同 ,经超速离心后 ,分布于不同的液层而分离 .超速离心也可用来测定蛋白质的分
子量 ,蛋白质的分子量与其沉降系数 S 成正比 .
蛋白纯化过程中 ,过完柱子后的上清称为什么 ?
铵、氯化钠、硫酸钠等 .盐析时 ,溶液的 pH 在蛋白质的等电点处效果最好 .凡能与水以任意比
例混合的有机溶剂 ,如乙醇、甲醇、丙酮等 ,均可引起蛋白质沉淀 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ2、电泳法 ：蛋白质分子在
高于或低于其 pI 的溶液中带净的负或正电荷 ,因此在电场中可以移动 .电泳迁移率的大小主要
取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小 .3、透析法 ：利用透析袋膜的超滤性质 ,可将大分
-70 ℃冰箱保存。）
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从 -70 ℃或 -20 ℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 过多次转接， 及贮存在 4 ℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在
经 5×107
个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的
手段， 它是微生物遗传、 分子遗传、 基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的
受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体
（R-,M- ），它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些
特殊方法（如电击法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
人人都爱 protocol 。。。。 蛋白的纯化 1. 菌液离心 取出三角瓶 ,倒入离心管中 ,离心 (6000rpm,10min,4 ℃ ),离心之后 ,倒去上清 . 2. 细胞重悬 加上 2mL 的 lysis buffer 洗沉淀 ,重悬细胞 . lysis buffer 配方是 HEPES (2M,PH 7.0)200 μNla, cl (4M) 500 μ lD, TT 3 μ l,Brij 100 μ l, PMSF 200 μ l,H2O 19ml,共 20ml 体系 . 3. 初步溶解 加入溶菌酶 20μｌ（ 100mg/ml ）于重悬液中 ,然后冰浴 20min. 再用 1.5ml EP 管分装 . 4. 冷冻
实验材料
(1) 大肠杆菌 DH5α （R- ， M- ， Amp- ） 实验步骤
（一）受体菌的培养
(1) 从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5 下振荡培养过夜（ 12h 左右）。
α单菌落，接种于 3～ 5mL LB 液体培养基中， 37 ℃
(2) 将该菌种悬液以 1:100 的比例接种， 取 250 μＬ菌液转接到 25mL LB 液体培养基中， 37 ℃ 振荡培养 2～ 3h 至 OD600 ＝ 0.5 左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备
标签：
tr..,Ca..,co.. 分类： 细胞技术 > 感受态细胞 来源：
实验管理实验概要
大肠杆菌感受态细胞的 CaCl2 法制备及质粒转化
实验原理 处于对数生长期的细菌经
CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸
收外源 DNA 的状态叫感受态。
在自然条件下， 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，
OD600 控制。对
TG1 菌株， OD600 为 0 ． 5 时，细胞密度在 5×107 个 /ml 左右。（应注意 OD600 值与细
胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体
细胞一般应是限制 -修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并
且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、试剂的质量
（三）感受态细胞的分装与冻存
(1) 在 2mL 制备好的感受态细胞中加入 2mL30% 甘油（即 1:1 体积，甘油终浓度 15%）。
(2) 将此感受态细胞分装成每份 200 μ L (1.5mL dorf 管 )，液氮速冻，快速转入 -70 ℃冰箱保
存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入
分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：
1）分子大小； 2）溶
解度； 3）电荷； 4）吸附性质； 5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离 .
常见的分离提纯蛋白质的方法有： 1、盐析与有机溶剂沉淀 ：在蛋白质溶液中加入大量中性
盐 ,以破坏蛋白质的胶体性质 ,使蛋白质从溶液中沉淀析出 ,称为盐析 .常用的中性盐有：硫酸
再加上 1ml 的 Imidazole buffer （ AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml
）冲洗 ,洗去非特
异性蛋白。 ⑷ 再洗脱目的蛋白
用 300μｌ的 Elution buffer 冲洗 ,获得所需的特异性蛋白 . Elution buffer 配方： AT buffer
DTT 3 μ l, urea 8M 18ml. 其余 buffer 均用 urea buffer 来配置 .
9.SDS-PAGE 的鉴定 ⑴配胶 (根据此蛋白的大小（ 55KD ） ,配置 12% 的胶 )
下 层 胶 的 配 方 :Acr/Bis 4.44ml, 下 层 胶 缓 冲 液 PH8.8
3.75ml,TEMED7 μ l,10%APS75 μ l,ddH2O6.8ml. 上 层 胶 的 配 方 是 : Acr/Bis0.75ml, 上 层 胶 缓 冲 液 PH6.8 1.5ml,TEMED
4 μ l,10%APS37.5 ⑵配置样品
μ l,ddH2O3.75ml.
每管加样品 2μl,5 ×loading buffer 4 μ再l,加 ddH2O 补全 20μｌ体系 . 混合好 loading buffer
和样品后 ,在 100 ℃下煮约 5min, 然后置室温下冷却后上样。
样品 1 ：纯化上清；样品 2 ：纯化沉淀；
对照 1 ：未纯化上清；对照 2 ：未纯化沉淀；对照 3 ：标准甘油激酶 ⑶上样 添加样品 ,上样 20μl,同时加上 Marker,10 μl. ⑷电泳 加上足够的电泳缓冲液 (1 ×),要加在两板内外 ,一定要浸没过板 ,形成电流通路 .调好电压进行
7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.
8. 纯化细胞破碎液的沉淀 用 urea buffer 重悬细胞沉淀 , 在常温温育 1h, 再离心 (12500rpm 1h 4 ℃),收集上清 ,重复上
清纯化步骤 .urea buffer 的配方是 Tris- HCl 1M PH8.0 1000 μl,NaCl 4M 1000 μl, Brij 20 μl,
-HCl buffer(PH 8.0) 到上清中。（碱性有利于蛋白的获得）可以先放
-80.
7. 纯化上清 ⑴ 准备 Ni 柱
在试管中加上空柱 ,缓慢滴加 300μｌ的 Ni 柱于空柱中 ,待其完全沉淀（每 300μｌ树脂液中有
5%Ni-NTA agnose ）。再用 2ml 的 AT buffer 平衡柱子（大约 1h ）。 AT buffer 配方：