实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备(新)
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
3-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验四：大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E·coli K——12X1776菌株的转化结果，认为：（1）大肠杆菌受体菌培养时间为OD550=0.2—0.3（5—6107细胞/毫升）最好；（2）菌体用预冷的CaCl2洗涤二次，效果较好；（3）100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率；（4）菌体在pH 为6.0 的溶液悬浮时最为适宜。
制备大肠杆菌感受态细胞的原理
制备大肠杆菌感受态细胞的原理嘿，朋友们！今天咱来唠唠制备大肠杆菌感受态细胞的那些事儿。
你想想啊，这大肠杆菌就好比是个小调皮，平时大大咧咧的，可咱得想办法让它变得乖乖的，好接受咱给它的新东西呀！制备感受态细胞呢，就像是给这个小调皮洗了个舒服的澡，让它能开开心心地迎接新变化。
咱为啥要费这劲去弄感受态细胞呀？这就好比你要给一个小朋友礼物，要是他不乐意接，那不是白搭嘛！所以咱得让大肠杆菌变得特别容易接受外来的东西，这样咱想给它导入个基因啥的，就容易多啦！那怎么弄呢？这可得有点小技巧啦！首先呢，咱得把大肠杆菌培养得好好的，就像给小树苗浇水施肥一样，让它茁壮成长。
然后，通过一些特殊的处理，让它的细胞膜变得更容易让东西进去。
这就好比是给大肠杆菌的家门开了个特别通道，让好东西能顺顺利利地进来。
这个过程可不简单哦，得小心翼翼的，就像你走钢丝一样，稍不注意就可能掉下去。
咱得控制好各种条件，温度啦、时间啦，都得把握得恰到好处。
这要是没弄好，那可就前功尽弃啦！哎呀，那得多可惜呀！你说这大肠杆菌感受态细胞制备难不难？其实也不难，只要你用心去做，就像对待自己最喜欢的宝贝一样，肯定能成功的。
等你成功制备出了感受态细胞，那感觉，就像自己打了一场大胜仗一样，开心得不得了呢！你想想，通过自己的努力，让这些小小的大肠杆菌变得乖乖的，能为咱所用，这多有成就感呀！而且这可是为后续的各种实验打下了坚实的基础呢，没有感受态细胞，好多实验都没法开展呀！所以呀，大家可别小瞧了这制备大肠杆菌感受态细胞的过程，这里面的学问大着呢！只要你肯下功夫，就一定能掌握这门技术。
加油吧，朋友们，让我们一起在生物学的海洋里畅游，探索更多的奥秘！这就是我对制备大肠杆菌感受态细胞的理解，大家觉得怎么样呢？是不是很有意思呀？原创不易，请尊重原创，谢谢!。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]
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行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以 满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面操 作：
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。
为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。
大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。
常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。
这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。
2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。
接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。
接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。
3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。
同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。
4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。
离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。
沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。
5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。
冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。
冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。
通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。
这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。
同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。
大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。
通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。
希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
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实验三大肠杆菌感受态细胞的制备
【课前预习】
1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？
2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？
【目的要求】
1、了解感受态细胞生理特性及制备条件；
2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法；
【基本原理】
所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖，重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小，转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。
CaCl2转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。
另外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效
期6个月）。
【实验用品】
（一）仪器与器皿
恒温振荡器、分光光度计、电动沉淀离心机、旋涡混合器、恒温培养箱隔、电热恒温、水浴锅、恒温摇床、普通冰箱、Eppendorf管、转液管、平皿、涂布棒、微量取样器、微波炉、三角烧瓶、试管、刻度离心管、保温瓶、酒精灯等。
（二）菌种
大肠杆菌DH5α（rk- mk- rec-）
（三）培养基与试剂
1、LB 液体培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母粉和0.5%NaCl，pH7.5。
）
2、100 mmol/ L CaCl2溶液
3、氨苄青霉素溶液（50 毫克/毫升）
4、CaCl2-MgCl2（80mmol/l MgCl2，20mmo/l CaCl2)溶液配制：
储存液配制：5M CaCl2配制：CaCl2·2H2O 36.75g→50mL H2O，37℃孵箱中放置过夜使之完全溶解，用除菌滤器过滤除菌；
2M MgCl2配制：MgCl2·6 H2O 20.3g→50mL H2O，高压灭菌。
工作液配制：
0.1M CaCl2-MgCl2配制：10ml: 5M CaCl2 40ul +2M MgCl2 400ul + H2O 9.56ml
【方法步骤】
（一）大肠杆菌感受态细胞制备
1、将大肠杆菌DH5α接种于LB平板上活化，置于恒温培养箱中37℃培养过夜。
2、挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落接种于一只装有5毫升LB液体培养基的灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。
3、转移0.5毫升过夜培养物于一只装有50毫升LB培养基（接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右）的灭菌三角瓶中，37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。
4、取1 毫升培养液以未接种的LB 作空白对照，在分光光度计上测OD600的光密度值，约为0.2-0.5 左右。
5、无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入1.5毫升EP 离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过），每组2 支。
室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞，弃培养基，保留细胞沉淀。
6、加入预冷的100mmol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2) 600微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把2支管转为1支，摇匀后于冰浴中放置30分钟。
7、4°C下，4000rpm离心10分钟收集细胞；弃MgCl2-CaCl2溶液，保留细胞沉淀。
8、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2的溶液中，并轻微打匀，冰浴放置2小时。
此时，可以将制备的细胞直接转化，也可以将细胞放置在4℃冰箱中，于1-7d内使用；也可以向细胞液中加入甘油，至甘油终浓度为10%，-70℃长期保存。
注：自己制备的感受态细胞用作下次质粒转化实验中。
【注意事项】
1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好。
2、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2-和MgCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制。
3、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所有器皿和试剂都要高温灭菌。
【实验结果】
将自己制作的感受态细胞拍照记录；
比较对照平皿和转化平皿，计算转化率；
【实验讨论】
感受态细胞制备时为什么要控制大肠杆菌的细胞生长期？
【实验知识补充】
为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：
1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：
（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；
（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；
（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：
（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；
（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；
（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E.coli K-12X1776菌株的转化结果，认为：在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。