(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞制备
大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐?5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12. 离心，弃上清液13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上)6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐?5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。
(完整版)大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab)
(Jin Quan-Wen Lab at XMU)
一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：
第Hale Waihona Puke 天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落， 接种入盛有 5ml LB 液体培养基的培养管中， 可以准备两管。 37 C，220rpm，培养过夜（ 14-16 个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（ 250-500ml）和几个 50ml 离心管，以备第二天离心收 集细菌用。
* Optimal efficiency is ca. 1X10 8 cfu/ gμDNA for general cloning. ** For library transformation, efficiency with ca. 1X10 9 cfu/ gμDNA is required.
感受态细胞制备简要流程： 收集细胞 冰水冲洗细胞 2 次 10% 甘油冲洗细胞 1 次 重悬细胞在 10% 甘油 分装
5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约 中。 4 C，4000rpm，离心 15 分钟。
500ml 冰水
6．弃上清，往离心管中加入少量 10%甘油 (灭菌，预冷 )，重悬菌体，再加 10% 甘油至终体积约为 20ml。 4 C, 4000rpm, 离心 10min 。
7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散 !），加入 2ml 10%甘油 (灭菌，预冷 )重悬 浮细胞。
二、电转化 [连接产物、纯化质粒或质粒 ]： 1．从 -80 C 冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。 2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。 3．将解冻的感受态细胞按照 40～ 100ul/管转移至预冷的 1.5ml 的离心管中，小
心混匀，冰上放置。 4．取 1-2 μl 纯化的质粒或克隆连接产物于 1.5ml 的离心管中，冰上放置 10min。
大肠杆菌感受态细胞得制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目得1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。
二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。
感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。
细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。
本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子得感受态细胞。
在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。
而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。
主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有:(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;(3)适量得溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。
证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞得转化理论尚未有统一结论,但就是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株得转化结果,认为:近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在p H6、0 得100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来得水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
实验6_大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
试剂 1、LB固体和液体培养基
LB培养基配方：（单位g/L）
胰蛋白胨 10
酵母提取物 5
NaCl
10
琼脂（1.5%） 15g （注：LB培养液不加琼脂）
按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂， 待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。 121℃湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中
pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码 信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主 细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶 （ β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这 种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物XGal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的 多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带 有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如 用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重 组质粒的细菌形成白色菌落。
4000rpm离心5分钟。
2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余 的过多水分）。
3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞 完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下4000rpm离心5分钟。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。
为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。
大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。
常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。
这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。
2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。
接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。
接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。
3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。
同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。
4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。
离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。
沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。
5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。
冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。
冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。
通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。
这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。
同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。
大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。
通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。
希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
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大肠杆菌感受态细胞的制备标签：tr..,Ca..,co..分类：细胞技术> 感受态细胞来源：实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。
）(1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。
(2)在4℃下，4000r/min离心10min。
弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。
(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。
(4)0～4℃4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。
（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）（三）感受态细胞的分装与冻存(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。
(2)将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。
（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。
）注意事项⑴、细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。
对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。
（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。
⑶、防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
人人都爱protocol。
蛋白的纯化1.菌液离心取出三角瓶,倒入离心管中,离心(6000rpm,10min,4℃),离心之后,倒去上清.2.细胞重悬加上2mL的lysis buffer 洗沉淀,重悬细胞.lysis buffer 配方是HEPES (2M,PH 7.0)200μl, Nacl (4M) 500μl, DTT 3μl, Brij 100μl, PMSF 200μl,H2O 19ml,共20ml体系.3.初步溶解加入溶菌酶20μl（100mg/ml）于重悬液中,然后冰浴20min.再用1.5ml EP管分装.4.冷冻将分装后的菌体放入-80℃冰箱里冷冻约20min（或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后, 取出待其融化。
5.细胞破碎融化之后破碎细胞,用超声波细胞粉碎机破碎,每次10s, interval 20s, 20次.若量大可用压榨机来破碎.6.离心离心细胞破碎液,12500rpm,1h,4℃,然后收集上清并转另一个1.5ml管,再加100μl 1M Tris -HCl buffer(PH 8.0) 到上清中。
（碱性有利于蛋白的获得）可以先放-80.7.纯化上清⑴准备Ni柱在试管中加上空柱,缓慢滴加300μl的Ni柱于空柱中,待其完全沉淀（每300μl树脂液中有5%Ni-NTA agnose）。
再用2ml的AT buffer 平衡柱子（大约1h ）。
AT buffer 配方：Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,NaCl 4M 1000μl,Brij 20μl,DTT 3μl, H2O 18ml.⑵上样加2ml上清到Ni柱中,并用2ml AT buffer 冲洗.(注意缓慢滴加)⑶洗脱样品加上1ml的salt washing buffer 冲洗,其配方是AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100μl.再加上1ml的Imidazole buffer（AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml）冲洗,洗去非特异性蛋白。
⑷再洗脱目的蛋白用300μl的Elution buffer 冲洗,获得所需的特异性蛋白. Elution buffer配方：AT buffer7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.8.纯化细胞破碎液的沉淀用urea buffer 重悬细胞沉淀, 在常温温育1h,再离心(12500rpm 1h 4℃),收集上清,重复上清纯化步骤.urea buffer的配方是Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,NaCl 4M 1000μl, Brij 20μl,DTT 3μl, urea 8M 18ml.其余buffer 均用urea buffer来配置.9.SDS-PAGE的鉴定⑴配胶(根据此蛋白的大小（55KD）,配置12%的胶)下层胶的配方:Acr/Bis 4.44ml,下层胶缓冲液PH8.8 3.75ml,TEMED7μl,10%APS75μl,ddH2O6.8ml.上层胶的配方是: Acr/Bis0.75ml,上层胶缓冲液PH6.8 1.5ml,TEMED 4μl,10%APS37.5μl,ddH2O3.75ml.⑵配置样品每管加样品2μl,5×loading buffer 4μl,再加ddH2O补全20μl体系. 混合好loading buffer 和样品后,在100℃下煮约5min,然后置室温下冷却后上样。
样品1：纯化上清；样品2：纯化沉淀；对照1：未纯化上清；对照2：未纯化沉淀；对照3：标准甘油激酶⑶上样添加样品,上样20μl,同时加上Marker,10μl.⑷电泳加上足够的电泳缓冲液(1×),要加在两板内外,一定要浸没过板,形成电流通路.调好电压进行电泳,约1h后,loading buffer条带跑到底,便可停止.⑸考马斯亮蓝染色①将电泳后的PAGE胶取下放入容器中,加入50ml双蒸水或去离子水,加热至沸腾后停止,继续在脱色摇床上摇动5min,弃去水溶液.②加上染色液,以浸没胶面为准,加热沸腾后保持状态30-60s,停止加热后继续在脱色摇床上摇动10min,弃去染色液.③加入约50ml的水,再加热至沸腾后保持沸腾状态30-60s,停止加热后在摇床上要5-10min,换水可完成脱色.④若要得到无背景的染色胶,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜.镍柱。
用不同浓度的咪唑洗脱。
因为咪唑和组氨酸都带正电，可在咪唑逐渐加大浓度的条件下洗脱目的蛋白。
protocol里有啊。
分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离.常见的分离提纯蛋白质的方法有：1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析.常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等.盐析时,溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好.凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白质沉淀.2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷,因此在电场中可以移动.电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质,可将大分子物质与小分子物质分离开.4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离.主要有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析等,其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量.5、分子筛：又称凝胶过滤法,蛋白质溶液加于柱之顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长,大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出,因此不同大小的蛋白质得以分离.6、超速离心：利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离.超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比.蛋白纯化过程中,过完柱子后的上清称为什么?我们称为流穿液.蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么？Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合.步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去.挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM.100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度.咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里2016.4.4周1：小摇：9点半，每个菌种5ml双抗培养基(5ml新离心管），分别1,2,4号菌种。