大肠杆菌感受态细胞的制备
实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备(新)
实验三大肠杆菌感受态细胞的制备【课前预习】1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？【目的要求】1、了解感受态细胞生理特性及制备条件；2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法；【基本原理】所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖，重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小，转化率愈高。
环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。
CaCl2转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。
另外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备标签：tr..,Ca..,co..分类：细胞技术> 感受态细胞来源：实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验三大肠杆菌感受态细胞的制备和转化内容提要采用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞。
碧云天生产的一步法感受态细菌制备试剂盒(One Step Competent Cell Preparation Kit) 是一种用于大肠杆菌感受态细菌快速制备的试剂盒。
一步法感受态细菌制备试剂盒是在经典的TSS法的基础上进行适当改良而成，既继承了TSS法的快速和简便，又在此基础上提高了感受态细菌的转化效率和易操作性。
使用本试剂盒可以使感受态效率达到106以上。
不仅可以转化质粒，而且可以转化普通的连接产物。
另外，对细菌的培养条件要求比较宽松，培养的细菌只要处于对数期内就可以使用本试剂盒制备感受态细菌。
本实验要求：1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术。
原理将质粒导入大肠杆菌或其他受体细胞内的过程叫转化(Transformation)。
受体细胞经过一系列处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许质粒分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
与电击法等其它方法相比，CaCl2制备法不但简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，若制备出的感受态细胞暂时不用时，即可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存半年以上，因此CaCl2法是分子生物学研究中最受欢迎的方法。
一、主要仪器、材料和试剂1. 仪器移液器，高速冷冻离心机，台式离心机，摇床。
2. 实验材料大肠杆菌E. coli DH5α菌株，1ml枪头，10ml离心管。
3. 试剂（1）1 mol/L CaCl217.9g CaCl2·2H2O溶于100ml水中。
（2）LB液体培养基：蛋白胨（Tryptone）10g酵母提取物（Yeast extract）5 gNaCl 10g溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水定容至1升，高温高压灭菌20分钟。
（3）LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉，高温高压灭菌。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
大肠杆菌感受态细胞制备
大肠杆菌感受态细胞制备实验材料实验器材：1.5ml 无菌EP管，无菌枪头，4℃离心机，恒温摇床，15/50 ml 无菌离心管实验试剂：碧云天一步法感受态细菌制备试剂盒（货号D00301），LB培养基，无抗性琼脂糖培养板实验步骤：1.涂平板：为取得最佳的感受态效率，必须先把甘油菌或其它形式保存的菌种涂LB平板（无抗性），并培养过夜；2.接种：取新鲜培养菌种的LB平板，从平板上挑取一个单克隆，然后把蘸有菌种的塑料枪头或牙签放到装有3毫升LB的细菌培养管内；3.培养：37℃约190-210rpm培养过夜，通常培养时间控制在16小时左右为宜，绝对不宜超过18小时；4.再接种培养：根据需要制备的感受态细菌的量，按照1:100的比例用新鲜培养的过夜菌接种培养。
例如取500微升的新鲜过夜菌到50毫升的LB中继续37℃200rpm培养。
通常在大约培养2-2.5小时后OD600可以达到0.3-0.5；5.制备感受态细菌：在培养的细菌OD600达到0.3-0.5时，4℃2000g离心5分钟收集细菌。
如果离心沉淀前的菌量为50毫升，按后续操作进行，如果是其它体积则按比例换算后进行后续操作。
用5毫升预冷的LB重新悬浮起细菌沉淀，加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受态制备试剂，混匀，冰浴放置5分钟。
然后再轻轻混匀，根据实验需要适当分装到1.5毫升或0.5毫升的离心管内-80℃保存。
注意事项：1.需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养和感受态效率的检测；2.尽管处于对数期内的细菌都可以用于感受态细菌的制备，但如果细菌生长的OD600的值达到0.3-0.5左右时，制备出来的感受态效果最佳；3.在制备感受态细菌的过程中均使用不含抗生素的LB。
在使用感受态菌的过程中热休克后的37℃培养时也必须使用无抗生素的LB，即便转入的质粒是有抗性的；4.实验全程在冰上操作可以提高感受态细菌制备效率。
感受态细胞的制备（氯化钙法）（1）将-80℃保存的DH-5α进行活化，在LB固体培养基平板上划线，平板倒置于37℃恒温箱中，过夜培养12-16h；（2）从平板上挑取单菌落接种于5ml液体LB试管培养基中，37℃震荡培养过夜；（3）按照1%~5%的比例将种子菌液接种于100ml新鲜的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.4~0.6(一般按照2%的接种量培养3h即可)后放置于冰上使其冷却以终止其快速生长；（4）将菌液转入50ml离心管中，在冰上放置10min，于4℃低温离心机以6000rpm/min的速度离心10min，收集菌液；（5）弃上清，加入1/10体积（10ml）预冷的感受态制备A液，用移液枪轻轻吹打使菌体重新悬浮，谨记吹打过程中给切忌用力过大以免破坏菌体，并冰浴10min；（6）冰浴后再次于4℃离心机中以6000rpm/min离心10min，弃上清在冰上加入2mlB液重悬菌体，最后按照100ul/cell分装，取100ul进行转化实验，检测其转化效率，剩余的放置在-80℃低温冰箱保存，半年之内可用，超过后转化效率会有所下降。
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细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。
）(1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。
(2)在4℃下，4000r/min离心10min。
弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。
(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。
(4)0～4℃4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。
（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）（三）感受态细胞的分装与冻存(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。
(2)将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。
（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。
）注意事项⑴、细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。
细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。
即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。
对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。
（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。
⑶、防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。
所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
人人都爱protocol。
蛋白的纯化1.菌液离心取出三角瓶,倒入离心管中,离心(6000rpm,10min,4℃),离心之后,倒去上清.2.细胞重悬加上2mL的lysis buffer 洗沉淀,重悬细胞.lysis buffer 配方是HEPES (2M,PH 7.0)200μl, Nacl (4M) 500μl, DTT 3μl, Brij 100μl, PMSF 200μl,H2O 19ml,共20ml体系.3.初步溶解加入溶菌酶20μl（100mg/ml）于重悬液中,然后冰浴20min.再用1.5ml EP管分装.4.冷冻将分装后的菌体放入-80℃冰箱里冷冻约20min（或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后, 取出待其融化。
5.细胞破碎融化之后破碎细胞,用超声波细胞粉碎机破碎,每次10s, interval 20s, 20次.若量大可用压榨机来破碎.6.离心离心细胞破碎液,12500rpm,1h,4℃,然后收集上清并转另一个1.5ml管,再加100μl 1M Tris -HCl buffer(PH 8.0) 到上清中。
（碱性有利于蛋白的获得）可以先放-80.7.纯化上清⑴准备Ni柱在试管中加上空柱,缓慢滴加300μl的Ni柱于空柱中,待其完全沉淀（每300μl树脂液中有5%Ni-NTA agnose）。
再用2ml的AT buffer 平衡柱子（大约1h ）。
AT buffer 配方：Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,NaCl 4M 1000μl,Brij 20μl,DTT 3μl, H2O 18ml.⑵上样加2ml上清到Ni柱中,并用2ml AT buffer 冲洗.(注意缓慢滴加)⑶洗脱样品加上1ml的salt washing buffer 冲洗,其配方是AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100μl.再加上1ml的Imidazole buffer（A T buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml）冲洗,洗去非特异性蛋白。
⑷再洗脱目的蛋白用300μl的Elution buffer 冲洗,获得所需的特异性蛋白. Elution buffer配方：AT buffer7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.8.纯化细胞破碎液的沉淀用urea buffer 重悬细胞沉淀, 在常温温育1h,再离心(12500rpm 1h 4℃),收集上清,重复上清纯化步骤.urea buffer的配方是Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,NaCl 4M 1000μl, Brij 20μl, DTT 3μl, urea 8M 18ml.其余buffer 均用urea buffer来配置.9.SDS-PAGE的鉴定⑴配胶(根据此蛋白的大小（55KD）,配置12%的胶)下层胶的配方:Acr/Bis 4.44ml,下层胶缓冲液PH8.8 3.75ml,TEMED7μl,10%APS75μl,ddH2O6.8ml.上层胶的配方是: Acr/Bis0.75ml,上层胶缓冲液PH6.8 1.5ml,TEMED 4μl,10%APS37.5μl,ddH2O3.75ml.⑵配置样品每管加样品2μl,5×loading buffer 4μl,再加ddH2O补全20μl体系. 混合好loading buffer和样品后,在100℃下煮约5min,然后置室温下冷却后上样。
样品1：纯化上清；样品2：纯化沉淀；对照1：未纯化上清；对照2：未纯化沉淀；对照3：标准甘油激酶⑶上样添加样品,上样20μl,同时加上Marker,10μl.⑷电泳加上足够的电泳缓冲液(1×),要加在两板内外,一定要浸没过板,形成电流通路.调好电压进行电泳,约1h后,loading buffer条带跑到底,便可停止.⑸考马斯亮蓝染色①将电泳后的PAGE胶取下放入容器中,加入50ml双蒸水或去离子水,加热至沸腾后停止,继续在脱色摇床上摇动5min,弃去水溶液.②加上染色液,以浸没胶面为准,加热沸腾后保持状态30-60s,停止加热后继续在脱色摇床上摇动10min,弃去染色液.③加入约50ml的水,再加热至沸腾后保持沸腾状态30-60s,停止加热后在摇床上要5-10min,换水可完成脱色.④若要得到无背景的染色胶,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜.镍柱。
用不同浓度的咪唑洗脱。
因为咪唑和组氨酸都带正电，可在咪唑逐渐加大浓度的条件下洗脱目的蛋白。
protocol里有啊。
分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离.常见的分离提纯蛋白质的方法有：1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析.常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等.盐析时,溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好.凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白质沉淀.2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷,因此在电场中可以移动.电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质,可将大分子物质与小分子物质分离开.4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离.主要有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析等,其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量.5、分子筛：又称凝胶过滤法,蛋白质溶液加于柱之顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长,大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出,因此不同大小的蛋白质得以分离.6、超速离心：利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离.超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比.蛋白纯化过程中,过完柱子后的上清称为什么?我们称为流穿液.蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么？Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合.步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去.挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM.100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度.咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里2016.4.4周1：小摇：9点半，每个菌种5ml双抗培养基(5ml新离心管），分别1,2,4号菌种。