大肠杆菌感受态细胞的制备
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备标签：tr..,Ca..,co..分类：细胞技术> 感受态细胞来源：实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・co li K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]
行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以 满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面操 作：
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞制备
大肠杆菌感受态细胞制备实验材料实验器材：1.5ml 无菌EP管，无菌枪头，4℃离心机，恒温摇床，15/50 ml 无菌离心管实验试剂：碧云天一步法感受态细菌制备试剂盒（货号D00301），LB培养基，无抗性琼脂糖培养板实验步骤：1.涂平板：为取得最佳的感受态效率，必须先把甘油菌或其它形式保存的菌种涂LB平板（无抗性），并培养过夜；2.接种：取新鲜培养菌种的LB平板，从平板上挑取一个单克隆，然后把蘸有菌种的塑料枪头或牙签放到装有3毫升LB的细菌培养管内；3.培养：37℃约190-210rpm培养过夜，通常培养时间控制在16小时左右为宜，绝对不宜超过18小时；4.再接种培养：根据需要制备的感受态细菌的量，按照1:100的比例用新鲜培养的过夜菌接种培养。
例如取500微升的新鲜过夜菌到50毫升的LB中继续37℃200rpm培养。
通常在大约培养2-2.5小时后OD600可以达到0.3-0.5；5.制备感受态细菌：在培养的细菌OD600达到0.3-0.5时，4℃2000g离心5分钟收集细菌。
如果离心沉淀前的菌量为50毫升，按后续操作进行，如果是其它体积则按比例换算后进行后续操作。
用5毫升预冷的LB重新悬浮起细菌沉淀，加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受态制备试剂，混匀，冰浴放置5分钟。
然后再轻轻混匀，根据实验需要适当分装到1.5毫升或0.5毫升的离心管内-80℃保存。
注意事项：1.需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养和感受态效率的检测；2.尽管处于对数期内的细菌都可以用于感受态细菌的制备，但如果细菌生长的OD600的值达到0.3-0.5左右时，制备出来的感受态效果最佳；3.在制备感受态细菌的过程中均使用不含抗生素的LB。
在使用感受态菌的过程中热休克后的37℃培养时也必须使用无抗生素的LB，即便转入的质粒是有抗性的；4.实验全程在冰上操作可以提高感受态细菌制备效率。
感受态细胞的制备（氯化钙法）（1）将-80℃保存的DH-5α进行活化，在LB固体培养基平板上划线，平板倒置于37℃恒温箱中，过夜培养12-16h；（2）从平板上挑取单菌落接种于5ml液体LB试管培养基中，37℃震荡培养过夜；（3）按照1%~5%的比例将种子菌液接种于100ml新鲜的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600=0.4~0.6(一般按照2%的接种量培养3h即可)后放置于冰上使其冷却以终止其快速生长；（4）将菌液转入50ml离心管中，在冰上放置10min，于4℃低温离心机以6000rpm/min的速度离心10min，收集菌液；（5）弃上清，加入1/10体积（10ml）预冷的感受态制备A液，用移液枪轻轻吹打使菌体重新悬浮，谨记吹打过程中给切忌用力过大以免破坏菌体，并冰浴10min；（6）冰浴后再次于4℃离心机中以6000rpm/min离心10min，弃上清在冰上加入2mlB液重悬菌体，最后按照100ul/cell分装，取100ul进行转化实验，检测其转化效率，剩余的放置在-80℃低温冰箱保存，半年之内可用，超过后转化效率会有所下降。
大肠杆菌感受态细胞制备
超净工作台
速离心机等
四、实验操作
1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～
5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，
37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～ 30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并 转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰 冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；
7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在 4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占 总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心 管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
五、思考题
制备感受态细胞时，应特别注意哪些环节？
三、实验材料与设备
1、用品与与仪器： 超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式
冷冻高速离心机、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒。
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸 水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pGEX-4T-2质粒(Ampr)。
四、实验操作
5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；
6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µ L冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置 片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
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操作步骤
细菌接种与培养
取-70℃冰冻大肠杆菌DH5α菌种，用划线 法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养 过夜。第二天，从平板上挑取单个菌落，接种 至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养 过夜。次日取菌液30 μL接种至含有3 ml LB培 养基的试管中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时 （200~300r/min）。
注意事项
防止污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，
所用器皿，如离心管，移液枪头等需要经高 压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，并注意 防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否 则会影响转化的效率或是转入杂DNA。
化学法则更加简备：
RuCl法 CaCl2法
其原理是细胞在低温，低渗CaCl2（0.1M）作 用下，会发生膨胀，Ca2+使细胞膜磷脂双分子层 形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部 分核酸酶解离开来，诱导细胞成为感受态细胞。 转化时混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷 酸复合物粘附于细胞表面，通过热刺激，液晶态 细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入细胞。
注意事项
细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直
接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用 已多次转接，或贮存在4℃的培养菌液。应用 对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定 培养液OD600控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时， 细胞密度在5×107 个/ml左右，过高或不足均 会使转化率下降。
大肠杆菌感受态细胞的制备
实验目的
1. 熟悉感受态细胞制备原理。 2. 掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方法。
实验原理
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用 转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中,一 般缺乏此种转移所必需的基因，因此不能自行完成从 一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体 转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感 受态以摄取外源DNA。经一定的理化方法诱导后，处 于适于摄取和容纳外源DNA的细胞，称为感受态细胞。
目前，制备感受态细胞已成为基因操作的常 规技术。感受态细胞:原核细胞或真核细胞。
特点： 细胞的通透性在制备过程中增强使其易于接
受外源基因。 细胞本身应为修饰、限制酶缺陷的菌株，使
外源DNA分子不易被切除或破坏。
制备感受态细胞可以使用电击法或化学法。
电击法是利用瞬时高压电流处理细胞悬浮液， 使细胞膜发生去极化，产生微孔，悬液中的 核酸就可通过微孔进入细胞。电击转化需要 仪器帮助
菌体收集
当菌落600nm OD值达到0.3~0.4时，将试 管取出放置冰上10~15分钟。在无菌条件下， 取1ml菌液装入1.5ml离心管中。4℃,5000rpm 离心5min。弃上清，将管倒置于干滤纸上 1min，吸干残留的培养液。
制备感受态
(振1)荡加混20匀0 μ，L 使冰菌预体冷悬的浮0.1，M冰Ca浴Cl320到m离in心。管中， (2) 4℃,5000rpm离心5分钟，弃上清，将管倒 置于干滤纸上，吸干残留液体。 (体3)，加放50至μ4L℃冰保预存冷备的用0.1，M2的4~C4a8C小l2，时重内悬使浮用菌效 果较好。如果暂时不用，可加入等体积的 30%的甘油（甘油终浓度为15%），混匀。液 氮速冻后保存于-80℃低温冰箱中待用，可保 存半年以上。