大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备标签：tr..,Ca..,co..分类：细胞技术> 感受态细胞来源：实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・co li K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
CaCl2法制备大肠杆菌感触感染态细胞[宝典]
![CaCl2法制备大肠杆菌感触感染态细胞[宝典]](https://img.taocdn.com/s3/m/48c624a668dc5022aaea998fcc22bcd126ff4203.png)
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理：转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。
受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。
准备：1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，高温高压灭菌；注：CaCl2必须为分析纯以上。
5.5492、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌；注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。
3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。
注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。
实验步骤：1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。
注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。
（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。
为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。
大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。
常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。
这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。
2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。
接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。
接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。
3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。
同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。
4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。
离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。
沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。
5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。
冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。
冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。
通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。
这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。
同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。
大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。
通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。
希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。
分子生物学实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验大肠杆菌感受态细胞的制备实验原理：转化是将异源DNA分子引入另一细胞系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。
受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，经过CaCl2等化学试剂的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
经过转化的细胞在选择性培养基上，可以筛选出转化体，即带有外源DNA分子的受体细胞。
实验目的：学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞过程。
实验内容：JM109感受态细胞的制备、一、实验材料和试剂大肠杆菌JM109或DH5α，LB固体/液体培养基，0.1mol/LCaCl2溶液。
二、主要设备台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液器、恒温摇床，等。
三实验方法1.受体菌的培养从于37℃培养16-20小时的新鲜LB平板上挑取新活化单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养（300rpm）12小时左右，直至对数生长后期。
将该菌悬液以1：100~1：50（V：V）的比例接种于100ml LB液体培养基，37℃下振荡培养2~3小时至OD600=0.35～0.5左右。
2.感受态细胞的制备（1）在无菌条件下，将培养液转入预冷的1.5ml离心管中，冰上放置20min，使其停止生长。
（2）4℃下，4000rpm离心5min，弃去上清。
（3）加入0.75ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置30分钟，4℃下4000离心5min。
（4）弃去上清，加入0.2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，贮存于4℃备用。
或贮存于-70℃（加10-30%的甘油），可保存半年。
四.注意事项：1、整个实验都应在无菌的条件下操作。
2、整个操作均在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率会降低。
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大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
具体步骤
1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。
9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。
注意事项
1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。
为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并
将各稀释维度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞散，从而使分光光度计读数得到标准化。
3. 对大多数大肠杆菌（MC106除外），采用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的结果。
Dagert和Ehrlieh的实验(1979)曾表明，细胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h，在贮存的最初12-24 h内，转化率增加4-6倍，然后降低到初始水平。
4. 克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板。
5. 菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α为0.4，要尽量保证OD值不要过高，更不能超过0.6。
6. 低温处理的时间，做完后冰上保存12-24 h后分装，并保存于-80℃。
7. 试剂和用品，所有的用品（离心管、药瓶等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl2溶液。