大肠杆菌感受态的制备
大肠杆菌感受态的制备注意事项
大肠杆菌感受态的制备注意事项一、前言大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
其感受态的制备是研究大肠杆菌生长和代谢机制的重要手段之一。
本文将从实验室条件、培养基、细胞处理等方面详细介绍大肠杆菌感受态的制备注意事项。
二、实验室条件1. 实验室应保持干净整洁，避免灰尘和异味影响实验结果。
2. 实验室应保持适宜的温度和湿度，避免过高或过低的环境温度对实验产生影响。
3. 实验室应定期消毒，确保操作台面、仪器设备等无菌。
三、培养基1. 选择合适的培养基是制备大肠杆菌感受态的关键。
常用的培养基有Luria-Bertani（LB）培养基、M9盐基培养基等。
根据实验需要选择适当的培养基。
2. 培养基应在使用前进行严格无菌处理，避免污染影响实验结果。
3. 培养基pH值应控制在合适的范围内，一般为7.0-7.5。
4. 培养基中添加的各种营养物质应按照实验要求精确称量，避免误差对实验结果产生影响。
四、细胞处理1. 大肠杆菌应在对数生长期进行处理，通常为OD600=0.6-0.8。
2. 细胞应在无菌条件下进行采集和洗涤，避免污染影响实验结果。
3. 细胞应在适当的温度下进行处理，一般为37℃。
4. 细胞处理过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。
五、感受态制备1. 感受态制备前应将培养基和细胞等物品预先冷藏或冰冻，以保证制备过程中温度控制的准确性。
2. 制备感受态前应先将培养基预热至37℃，并加入相应浓度的感受态诱导剂（如IPTG）。
3. 加入诱导剂后，将细胞转移到含有诱导剂的培养基中，并在适当温度下孵育一定时间（通常为2-4小时）。
4. 制备过程中应注意避光，避免光照对实验结果产生影响。
5. 制备完成后应及时取样，避免长时间放置影响实验结果。
六、结论以上是大肠杆菌感受态制备的注意事项。
在实验过程中，我们应该严格按照要求进行操作，保证实验结果的准确性和可靠性。
同时，在实验室管理方面也要加强管理，保证实验室环境的卫生和安全。
大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）实验目的1.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
2.了解大肠杆菌感受态细胞的生理特性和制备原理。
实验原理受体或宿主细胞容易接受外源DNA的状态称为感受态，通过物理或化学的方法，人工诱导细胞成为敏感的感受态细胞，以便外源DNA 进入，从而实现外源DNA在宿主细胞内大量复制和表达。
在低温、低浓度CaCl2的作用下，大肠杆菌细胞膜的磷脂双分子层形成液晶结构，细胞外膜和细胞内膜间隙中的部分核酸酶解离，细胞膜的通透性增加，此时大肠杆菌成为感受态细胞。
实验器材高温高压灭菌锅、超净工作台、牙签、移液器、移液器吸头、离心管、离心管架、EP管、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机等。
实验试剂（1）培养基：LB，LA。
（2）溶液：10%甘油+0.1mol/L CaCl2溶液，0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液。
（3）菌株：E.coli DH5α。
实验操作（1）用灭菌的牙签蘸取少量E.coli DH5α菌液划线接种于LA 培养基上，放在恒温培养箱37℃培养后，挑取单菌落接种于10ml LB 培养基中，于37℃摇床、200rpm过夜培养。
（2）按1∶100的接种比例将过夜培养的菌液转接至100～200ml 的LB培养基中，于37℃摇床、200rpm培养3～4h，使菌液的OD600达到0.6～0.8。
（3）冰浴菌液30min，同时将灭菌过的离心管、移液器吸头、“10%甘油+0.1mol/L CaCl2”溶液等放进冰箱预冷，在超净工作台中将菌液分装到预冷的50ml的离心管中，于4℃离心机中4000rpm离心15min。
（4）离心后尽量除去培养液，用预冷的“0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液”重悬菌体，冰浴25min后，于4℃离心机中4000rpm离心15min。
（5）离心后弃去上清液，重复步骤（4）一次。
（6）弃去上清液后，将菌体重悬于冰冷的“10%甘油+0.1mol/LCaCl2溶液”中，按每管80μl分装至预冷的灭菌的EP管中，-80℃保存备用。
大肠杆菌感受态的制备与转化
大肠杆菌DH5α感受态的制备于转化：CaCl2法1）、挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃、200r/min，培养16小时。
2）、取1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的烧瓶中（按1：100的比例）。
于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。
3）、在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min。
4）、于4℃、5000r/min离心5min，倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
5）、用10ml冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上30min。
6）、于4℃、4000r/min离心10min，倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
7）、每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，加甘油至终浓度为15～20％）。
此时，可以迅速将细胞分装成小份（200μl/份），液氮中冰冻，-70℃贮存备用。
将质粒转化到大肠杆菌DH5α中1）、感受态细胞悬液200μl离心管，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。
2）、将离心管放到预加温到42℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。
3）、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。
4）、每离心管加800μl LB培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
5）、将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB培养基上。
6）、将平板置于室温至液体被吸收。
7）、倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
3大肠杆菌感受态细胞转化效率的测定1）、准备2 个LB/氨苄平板，涂板前将平板平衡至室温。
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
将分装后的菌体放入 -80 ℃冰箱里冷冻约 20min （或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后 , 取 出待其融化。 5. 细胞破碎 融化之后破碎细胞 ,用超声波细胞粉碎机破碎 ,每次 10s, interval 20s, 20 次 .若量大可用压榨 机来破碎 .
6. 离心 离心细胞破碎液 ,12500rpm,1h,4 ℃ ,然后收集上清并转另一个 1.5ml 管 ,再加 100μl 1M Tris
所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 ⑶、防止杂菌和杂 DNA 的污染
4 ℃。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿， 如离心管， 移液枪头等最好是新的， 并经
高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、
DNA 酶或杂 DNA 所污染，
否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。
(3)30% 甘油： 30mL 甘油溶于 100mL 蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1) 超净工作台 (2) 冷冻离心机 (3) 恒温摇床 (4) － 70 ℃冰箱 (5)10mL 移液管 (6) 吸耳球 (7)1mL 、200 μＬ移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL 离心管
大肠杆菌感受态细胞的制备
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实验管理实验概要
大肠杆菌感受态细胞的 CaCl2 法制备及质粒转化
实验原理 处于对数生长期的细菌经
CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸
收外源 DNA 的状态叫感受态。
在自然条件下， 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，
OD600 控制。对
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态的制备
大肠杆菌感受态的制备(1)取出保存在-80℃的甘油菌种，取1μl接种在1mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜；(3)按照1：100的比例转瓶于50 mL LB液体培养基。
37℃剧烈震荡；(4)待菌生长到对数中期OD600=0.4~0.6，约需要几小时，然后将菌液转入50 mL无菌离心管中，在冰上放置15分钟，待菌液冷却后于4℃、8,000rpm离心4分钟，收集菌体，弃去培养液；(5)在沉淀中加入O.1M预冷的CaCl2 20 mL，洗涤重悬菌体，离心收集，弃去上清液；(6)加入0.1M CaCl2(冰上预冷)2mL重悬菌体。
置于冰上，48小时内均可使用，12小时后大肠杆菌感受态细胞效率将提高3~4倍；加入0.5 mL无菌甘油使其终浓度为20％(v/v)，以每管100μl分装于1.5mL无菌离心管中，-80℃保存待用。
大肠杆菌的转化1)将从-80℃冰箱中取出的200μl感受态细胞放在冰上融化。
2)加入5-10μl的质粒或连接产物，轻轻混匀内容物，冰浴30min。
3)将EP管迅速放入42℃的水浴中热激2min。
4)快速将EP管转移到0℃冰浴中，使细胞冷却2min。
5)每管加入800μl SOC活化培养基，37℃，180r/min摇床培养1h。
6)最后离心2min，将菌体涂布于LB+抗生素的平板上，将平板置于室温直至液体被吸收。
倒置平板，于37℃培养，12～16h左右可出现菌落。
农杆菌8的菌株活化与感受态的制备(1)取出保存在-80℃的C58甘油菌种，取1μl接种在1mL LB液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜；(2)按照1:100的比例转瓶于50 mL LB液体培养基，LB培养基中加50mg/L的硫酸庆大霉素。
28℃200rpm震荡培养过夜；(3)等OD600为0.4~0.6时停止培养，约需8h左右；(4)将菌液转入50mL无菌离心管中，在冰上放置30分钟，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。
感受态大肠杆菌制备方法
感受态大肠杆菌制备方法四川大学生命科学学院试剂配制：A液：1M，MnCl2；mol/LB液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液：称取CaCl20.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
TB缓冲液：方法步骤：1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，3、其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，4、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10×8，好时可到10×9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
大肠杆菌感受态细胞制备
超净工作台
速离心机等
四、实验操作
1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～
5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，
37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～ 30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并 转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰 冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；
7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在 4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占 总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心 管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
五、思考题
制备感受态细胞时，应特别注意哪些环节？
三、实验材料与设备
1、用品与与仪器： 超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式
冷冻高速离心机、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒。
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸 水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pGEX-4T-2质粒(Ampr)。
四、实验操作
5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；
6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µ L冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置 片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
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五、本实验所需要掌握内容
掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休 克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰 浴，冷却1－2分钟。
9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分 钟。
10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的 LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放 置几分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM 的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即 成感受态细胞悬液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存 于-70℃可保存半年。 取其中一份进,轻度摇晃混合 后于冰上放置30分钟。
实验二、大肠杆菌感受态的制备
一、实验原理
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制 备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此 条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。
三、实验步骤
11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。
四、实验注意事项
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细 胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下 进行。
在一定条件下，经过连接后的ＤＮＡ片段与感受态细胞混合保 温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的ＤＮＡ分子通过复 制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转 化体，即带有异源ＤＮＡ分子的受体细胞。
二、实验所需器材和试剂
器材： 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作 台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微 量移液枪。
1.挑取一DH5α单菌落于5ml LB培养液中37℃过夜培养
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中， 37℃振摇培养至OD600值达到0.5-0.6之间
3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞， 冰浴30分钟