CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
感受态菌的制备原理、仪器试剂和操作步骤
感受态菌的制备原理、仪器试剂和操作步骤1．目的学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
2．原理细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。
3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。
4．试剂E. coli XL1-Blue，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌ddH2O5．实验准备1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌ddH2O，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。
6．操作步骤（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。
（2）从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种，放置在冰上。
在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。
（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD600为0.375（<0.4~0.6，细胞数<108/ml，此为关键参数！）。
以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。
（4）将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10m in，然后于4℃，5000rpm离心 10min。
（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。
（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。
（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100ml分装到1.5ml离心管中。
大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化
大肠杆菌的CaCl2化学感受态细胞制备和转化准备工作：1、LB琼脂平板若干。
2、50mL离心管若干，加满超纯水后于121℃20分钟灭菌备用。
3、含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶若干，121℃20分钟灭菌烘干。
4、1.5mL离心管若干，121℃20分钟灭菌烘干。
5、22﹪灭菌甘油溶液：22mL甘油加入78mL超纯水，121℃20分钟灭菌，保存于4℃。
试剂：1、100mL1mol/LCaCl2溶液：14.7gCaCl2.2H2O用超纯水配制成100mL贮存液，灭菌备用，保存于4℃冰箱。
2、100mL0.1mol/LCaCl2溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL灭菌超纯水混匀，保存于4℃冰箱。
3、100mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加90mL22﹪的灭菌甘油溶液，混匀，保存于4℃冰箱。
感受态细胞制备：1、晚上从－70℃冰箱活化大肠杆菌（如DH5α或JM109），划LB平板，37℃培养过夜。
2、晚上从培养平板上挑取单菌落接种到一支3mLLB液体培养基试管，37℃培养过夜。
3、早上按1：100比例将过夜培养菌液接种到含有50mLLB液体培养基的250mL 三角瓶中，200rpm，37℃培养1-2hr左右，测OD600到0.2-0.3时，转到50mL离心管，冰浴10分钟左右。
4、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。
5、去上清，用0.1mol/L10mLCaCl2溶液重悬菌体，水浴20分钟左右。
6、以4000rpm，在4℃冷冻离心收集菌体。
7、去上清，将收集的菌体用1mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液重悬，分装成100μl每个离心管，与－70℃保存。
8、必要时以浓度已知的标准质粒转化制备的感受态细胞以估计效率。
转化：1、从－70℃冰箱取出含有感受态细胞的离心管，在超净台上冰浴，待其融化后，加入连接产物或对照质粒，冰浴30分钟。
2、将离心管从冰浴取出并迅速转到42℃水浴热激90s，然后转冰浴2分钟。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。
取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备感受态细胞下面的方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。
该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且快速，重复性更好。
该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。
１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。
为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞/ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。
在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各浓度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。
２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。
切记：下述所有步骤均需无菌操作。
３）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
４）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
５）以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
我们发现将１mol/L CaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。
制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。
对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。
６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。
感受态细胞制备与转化
Ⅰ、CaCl2法制备感受态细胞（大肠杆菌）①挑取37℃培养16-20h的单菌落（直径2-3mm）于含有100mlLB或SOB的500或1000ml 的三角瓶中，剧烈振荡培养3h至OD值为0.2-0.4（据文献大肠杆菌DH5α菌株培养物OD 值为0.2-0.4时，约含109个菌/ml；②转移菌体至无菌、一次性冰冷的50ml聚丙烯离心管内。
将离心管内培养物放置于冰上10min，以使其冷却至0℃；③将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；④弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑤用30ml冰冷MgCl2-CaCl2溶液（80mM MgCl2和20mM CaCl2）漩涡振荡重悬菌体沉淀，置于冰上10min；⑥将离心管内培养物4℃，4000rmp，10min以收集菌体；/⑦弃去上清培养基，并颠转离心管放于一叠吸水纸上1min，吸取多余培养基；⑧用2ml冰冷0.1MCaCl2溶液（2ml冰冷0.1MCaCl2/50ml原初培养物）漩涡振荡重悬菌体沉淀；⑨放于4℃冰箱14-20h。
获得的感受态细胞即可直接用于转化或添加甘油至终浓度10%（7:3,7是菌液，3是甘油），分装离心管内（150-200μl），存于-70℃。
感受态细胞的冻存制备①每4ml重悬细胞中添加140μlDMSO，轻摇混匀，冰上放置重悬物15min；②另外每管重悬物中再添加140μlDMSO，轻摇混匀，重新放于冰浴中；③迅速将重悬物分装于冷的、无菌小管内，将小管浸入液氮中瞬时冰冻感受态细胞，将小管存于-70℃冰箱。
Ⅱ、大肠杆菌转化①CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞Luria-Bertani（LB）培养基（1L）：胰蛋白胨（10g），酵母提取物（5g），NaCl（10g）pH7.5/NaOH，dH2O至1L，灭菌LB平板：LB培养基（500ml），Agar（7g），灭菌。
冷却55-65℃倒平板。
实验四感受态细胞的制备和连接产物的转化
实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化一、实验原理与目的法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；学习CaCl2掌握外源DNA重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。
感受态就是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发处展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。
用CaCl2理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。
冷冻也能增加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。
二、材料与试剂0.1mol/L CaCl2溶液:称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
含15%甘油的0.1mol/L CaCl2: 称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
1.5ml EP管、灭菌枪头、移液枪、冰盒、低温离心机、涂布棒、大肠杆菌DH5a、重组质粒（实验三的连接产物）、LB固体培养基、氨苄青霉素三、实验方法1、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl法）21）取-70℃超低温冰箱保存的大肠杆菌DH5a菌液30μl（过夜菌液约16小时）接种于3ml LB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm）培养过夜。
2）将过夜培养的菌液1ml移入100ml LB培养基中，37℃快速振荡（250rpm），至OD=0.4—0.6（约2小时）；冰上30min。
3）取10ml培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4000g离心10分钟。
4）弃去上清,用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下4000g离心10分钟。
5）弃去上清,加入2ml预冷的含20%甘油的0.1mol/L的CaCl2 溶液重悬,即成感受态细胞悬液。
CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤
重组
目的：
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略
一种挑取重组子克隆的简易方法
凡经过体外DNA重组以后,都要通过挑取重组子克隆的方法将改变以后的DNA序列固定下来。通常挑取克隆是一项十分繁琐费时的工作,特别对于连结效率较低、自连机率高的情况,通过碱裂解法或煮沸法提取质粒常常是事倍功半;另外一种情况是重组质粒向农杆菌转化后的检测过程中,由于提取农杆菌的质粒通常获得的质粒量很少,且背景不干净,因此难以对酶切结果作出判断。针对上述情况,我们在实践中使用了PCR方法挑取重组子克
1. 4转化菌落的备份及菌落PCR反应物的制备
将B21, 32葡聚糖酶基因与植物表达载体pB in438的连接产物转化大肠杆菌DH5A感受态细胞,并涂布于含卡那霉素(50 Lg·m l- 1)的LB培养基上, 37℃培养过夜,待菌落长至1～2mm时,用灭菌的牙签沾取全部菌落先在预先分格并标记数字的另一块平皿上轻沾一下,然后在PCR反应混合液(PCR反应缓冲液、dN TP、引物、Taq DNA聚合酶、dH2O )中同样轻洗一下,依次将需挑取的克隆全部在另一块平皿上备份,并将剩余菌洗入对应的PCR
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞
实验5 细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞实验目的：明确培养基的配制原理；通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。
实验原理：重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
大肠杆菌与其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此。
菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等℃，由于在-70℃或液氮中冻存，细菌内保护剂。
目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0~-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。
因此，为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。
甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。
贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
甘油的使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。
在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。
复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。
培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物。
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CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
原理：
转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。
受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。
准备：
1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油(可用0.1mol/L CaCl2和30％甘油等体积混合)
混合溶液，高温高压灭菌；
注：CaCl2必须为分析纯以上。
2、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，
高温高压灭菌；
注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。
3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液
体培养基
（
）中，37℃振荡培养过
夜至对数生长中后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。
注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。
实验步骤：
1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。
注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。
（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。
2、用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟。
注：（1）洗去细菌碎片和残留的培养液；（2）洗涤时间宜短不宜长。
3、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分
钟，4℃5000g离心5分钟。
注：此时可见细菌沉淀为白色，体积也胀大为最初沉淀体积的数倍。
4、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感
受态细胞悬液。
分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
注：（1）最好在2月之内用完，然后重新制备；（2）若要进一步提高转化效率，可将加入的溶液体积减少到1ml，或分装为200μl/管。
说明：
1、我本人在对比了数种CaCl2法制备感受态细胞的方法之后，确定此方案是转
化效率最高且最简易的方案,其转化效率只比电转化相错1~2个数量级。
2、尽量在超静工作台内操作。
3、本方案用于DH5α、JM109、XL-10、BL-21等系列E.coli，其它的菌种尚未
试用。