大肠杆菌感受态细胞制备
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
一、实验步骤（无菌操作）
1） 划线：挑取大肠杆菌 DH5α(-80℃,第三层)平板划线，培养 12-16 h 2） 接菌：取 10 ml 试管加入 2 mlLB 液体培养基，从平板上挑取单克隆接种，37℃，220 r/min， 培养 12-16 h 3） 扩大培养： 取 500 ul 培养菌以菌液/新鲜 LB （1:10） 的比例接入 5 ml 的新鲜 LB 培养基， 37℃， 220 r/min，直至 OD600=0.4-0.5（一般约 2-3 h），然后将菌液冰浴 30-60 min 4） 离心 1：4℃离心，4000 r,10 min，弃上清 5） CaCl2 1：加入 1 ml0.1 M CaCl2 溶液，Байду номын сангаас轻用枪头吹打，充分悬浮，冰浴 10 min 6） 离心 2：4℃离心，4000 r,10 min，弃上清 7） CaCl2 2：加入 0.5 ml0.1 M CaCl2 溶液，轻轻用枪头吹打，充分悬浮，冰浴 30 min 8） 甘油：加入等体积的 60%甘油溶液，甘油终浓度为 30% 9） 分装：小心充分混匀，分装入管（100 ul/tube）, -80℃保存
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
年夜肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项之答禄夫天创作时间：二O二一年七月二十九日1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必需导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及把持统称为重组DNA分子的转化.在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很年夜的关系. 所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可年夜年夜增进转化的作用.细胞的感受态一般呈现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键.制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保管有效期6个月.2、转化的概念及原理在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法.它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法,如电击法、CaCl2等化学试剂法处置后,使细胞膜的通透性发生变动,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞呈现新的遗传性状.年夜肠杆菌的转化经常使用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的.其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞概况,经42℃短时间热冲击处置,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中重组子中基因获得表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子.Ca2+处置的感受态细胞其转化率一般能到达5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验.如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处置细菌,则可使转化率提高100~1000倍.化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保管,因此被广泛用于外源基因的转化.除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠长久的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能到达109~1010转化子/ug闭环DNA.因把持简便愈来愈为人们所接受.3、感受态细胞制备及转化中的影响因素⑴、细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保管的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.不要用已经过屡次转接及贮存在4℃的培养菌液.细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳.即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制.对TG1菌株OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.密渡过高或缺乏均会使转化率下降.另外受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配.⑵、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比但当加入的外源DNA的量过多或体积过年夜时则会使转化率下降.一般地,DNA溶液的体积不应超越感受态细胞体积的5%1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞到达饱和.对以质粒为载体的重组分子而言,分子量年夜的转化效率低,实验证明年夜于30kb的重组质粒将很难进行转化.另外重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA年夜都构成环状双螺旋分子.⑶、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯洁的水配制,最好分装保管于4℃.⑷、防止杂菌和杂DNA的污染整个把持过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管、移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处置.所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染否则均会影响转化效率或杂DNA的转入.⑸、整个把持均需在冰上进行不能离开冰浴否则细胞转化率将会降低.时间：二O二一年七月二十九日。
大肠杆菌感受态细胞-CaCl2制备
用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞1. 仪器耗材仪器：冷冻离心机，恒温振荡器，超净工作台，紫外分光光度计。
耗材：玻璃试管，锥形瓶，50ml聚丙烯管（预冷），冰盒，1.5ml离心管，液氮。
2. 试剂及配制LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，备用。
0.1mol/L的CaCl2-MgCl2：76g MgCl2，22.2gCaCl2，定容至1L。
0.1mol/L 的CaCl2：取出1mol/L的CaCl2（11.1gCaCl2加入到100ml四蒸水中）灭菌贮存液10ml加90ml灭菌水稀释至100ml。
1mol/L的CaCl2贮存液事先0.22微米滤膜过滤除菌，后保存于4℃。
3. 实验步骤（1）从37℃培养16-20h 平板中挑取一个单菌落（直径2-3mm），转到一个含有4ml LB 培养基的玻璃试管中，37℃，250rpm振摇过夜培养。
（2）将过夜培养物以1：100的比例转接到含有100ml LB培养基的锥形瓶(500ml)中，37℃，250rpm振摇培养至对数生长期，一般需1.5-3h。
（3）将培养物转移到无菌、冰预冷的2个50ml聚丙烯管中（不要装太满以防离心管破裂），冰上放置10min。
（4）4℃，4100rpm离心10min，以回收细胞。
（5）倒出培养液，将试管倒置1min，以使最后的痕量培养液流出。
（6）沉淀用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2-MgCl2（每50ml初始培养液用30ml）溶液重悬。
（7）4℃，4100rpm离心10min，倒出培养液（方法同5），回收细胞。
（8）每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/L 的CaCl2重悬沉淀。
（9）每2ml重悬细胞液加70μl DMSO（二甲基亚砜），轻轻旋转混匀之，将悬液置于冰上15min。
（10）每2ml细胞悬液再加70μl DMSO，轻旋混匀，至于冰上15min；（11）迅速将悬液以50-100μl每份分装到冷却的无菌1.5ml离心管中，用封口膜封口，投入液氮中快速冷冻（约1min），贮存于-80℃冰柜。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。
通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。
实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。
引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。
然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。
本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。
材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。
2. 培养基：LB培养基。
3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。
4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。
5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。
结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。
通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。
然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。
转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。
最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。
为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。
将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。
实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。
感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。
通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。
本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。
感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)
感受态细胞的制备（DH5α）一、准备工作所有试剂、容器均需提前预冷。
1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。
② SOB培养基（Super Optimal Broth）③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl20.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
（装在50ml离心管，封口4度保存）④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl20.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。
配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。
（50ml离心管分装）在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。
2.配制2 M MgCl2溶液。
（50ml离心管分装）在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。
5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。
5大肠杆菌感受态细胞的制备、转化与鉴定
五、重组子的筛选
1、耐药性基因
2、蓝白斑筛选
大肠杆菌感受态细胞的 制备、 制备、转化与鉴定
Байду номын сангаас 一、目的
把体外重组的DNA 引入 受体细胞
二、原理
（一）遗传物质的传递 （二）受体菌的选择与改造
三、感受态细胞的制备
氯化钙法： 1、划平板培养菌种 2、挑单菌落培养过夜 3、菌体的扩大培养
以下步骤均在冰浴中进行
4、.4℃离心，4000rpm×10min，弃去上 清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮 30min 5、.4℃离心,4000rpm×10min，弃去上清， 加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬 浮。 以100μl/管分装入1.5ml离心管中， -70℃冻存备用。
四、感受态细胞的转化
1、取100μl贮存于-70℃钙化菌， 冰浴化开； 2、加入适量连接产物，轻混匀，冰 浴20min; 3、于42℃热休克90s，迅速转移至 冰浴中，继续冰浴2-3min;
4、.加入LB液体培养基200μl，于37℃缓 摇孵育45min; 5、将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板 （根据质粒性质添加抗生素或/和XGal/IPTG），待胶表面没有液体流动 时，37℃温箱倒置培养12-16hr。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
完整版大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备标签：tr..,Ca..,co..分类：细胞技术> 感受态细胞来源：实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液液体培养基(2)LB．(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）
感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）一、准备工作1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，紫外通风橱（提前一天预约）；0.22μm的滤器2个，10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管30个，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml 玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制① LB平板② TYM培养基：分别称取胰蛋白胨4g，NaCl 1.46g，酵母提取物1g，MgSO4 0.62g，至于250ml烧杯中，加入120mlDDW，摇晃，使其全部溶解，用浓NaOH调节PH值为7.5，最后定容至200ml，转入至500ml锥形瓶，高压灭菌，4℃保存。
③ TfBⅠ：分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml 烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
④ TfBⅡ（每次现用现配）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl20.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
二、实验步骤1、将DH5α甘油菌从-80℃冰箱中拿出来放在冰上，用枪头吸蘸取或取少部分菌液加到无抗生素的LB平板边缘，在火上稍微烧一下枪头，在平板侧壁上冷却枪头，同时使其顶端变圆变钝。
划线接种，倒置放入37℃恒温箱过夜。
注：①尽量在菌液融化前挑取，反复冻融对菌体有损伤。
②吸取菌液后，尽可能快把甘油菌放回-80℃冰箱。
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大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐?5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12. 离心，弃上清液13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上)6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐?5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。
先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞12. 离心，弃上清液13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存转化方法:1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上)6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养大肠杆菌感受态细胞的五种制备方法方法一：细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。
用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。
本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。
操作过程简述如下。
1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。
2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。
3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。
4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。
6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。
7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。
9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。
10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。
11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。
12．每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。
14．将平板置于室温至液体被吸收。
15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
方法二：CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。
与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。
准备工作：1．从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。
挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml LB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养。
2．次日从5ml LB培养物吸取200μl转入50ml LB培养基中（250ml 锥形瓶），37℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。
感受态细胞的制备：3．吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。
4．加入100μl预冷的Solution A，悬浮菌体，冰浴30分钟。
5．此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。
细胞转化：6．在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42℃1分钟热击，再次冰浴2 分钟。
加入0.9ml LB 培养基，20μl Solution B，37℃，振荡培养1小时。
7．取适当菌液（100-200μl）涂布相应抗性的平板。
8．过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。
补充说明：1．所用器具一定要清洁；2．操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml 锥形瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；3．在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ，效果会更好一些；4．为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6；5．制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；6．细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。
方法三：1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.33、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。
4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。
方法四：（1）将1ml过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。
于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。
（2）将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。
（3）弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mMCaCl2和10mm Tris•HCl （pH8.0）无菌冷冻液体中。
（4）将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。
（5）弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris•HCl（pH8.0）无菌冷冻中。
此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。
200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。
方法五：TSB法（也是本人热衷的方法）1.药品制备1M Mg2+ (1M MgSO4 和1M MgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。
TSB液（30mL/ 80mL菌液）（现配现用）：PEG3350 3gTryptone 0.3gYeast extract 0.15gNaCl 0.3g以上1210C, 15min 灭菌后，加入1M Mg2+600uL , 以及DMSO 3mL2. 步骤：（1）活化菌株（2）挑单菌落培养于5mL 的液笨培养基中（3）取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养（4）370C培养3－4小时，OD600在0.4－0.6（5）离心，去上清（6）加入20mLTSB，重悬（7）离心，去上清（8）加入10mLTSB，再加入15－20%的甘油，分装保存注，整个操作过程均应在冰上进行。