农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。
感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。
农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。
制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。
三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。
材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。
20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态制备和转化方法(一)普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。
6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
7. 液氮中冷冻1分钟。
8. 37℃水浴溶化细胞。
9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
11. 涂板，28℃培养2-3天。
(二)电转农杆菌感受态细胞制备与转化1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。
（如用5mlYEP，需培养36h）2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。
3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。
5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
6．重复4、5步骤2~3次。
7．用2ml冰浴的10%甘油重悬。
8．每管100µl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH 调pH至7.0，灭菌后待用。
注：HEPES需现用现配。
电击法转化农杆菌感受态细胞1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。
2．加2µl质粒DNA于100µl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。
农杆菌感受态细胞的制备
农杆菌感受态细胞的制备（以GV3101菌株为例）：1.在新铺制的加有20 mg/L Gen（庆大霉素）、50 mg/L Rif的YEB固体培养基上，用接种环或灭菌牙签“平板划线法”通过分区划线稀释分离得到农杆菌GV3101菌株的单克隆菌落。
2.挑选一个单克隆菌落，接种到5 mL新鲜的加有20 mg/L Gen、50 mg/L Rif的YEB液体培养基中，置摇床上28℃振荡培养过夜。
3.将过夜摇浓的GV3101菌液按1: 100比例接种到50 mL新鲜YEB液体培养基中，置28℃摇床，200 r/min振荡培养至OD600为0.5左右，将菌液转移至50 mL离心管，冰浴30 min。
4.集菌：将菌液置于4℃预冷的离心机中离心，4,000 r/min，10 min。
5.重悬：弃上清，加入10 mL预冷的0.15 M NaCl溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，4,000 r/min，4℃离心10 min。
6.重悬：弃上清，加入1 mL预冷的20 mM CaC12溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，分装至预冷的1.5 mL无菌离心管中，液氮速冻后，-80℃保存备用。
农杆菌感受态细胞的转化（冻融法）：将农杆菌感受态细胞从-80℃取出后置冰上自然解冻，在超净台中用无菌枪头吸取2 μL质粒加入到感受态细胞中，轻轻吹打混匀后于冰上静置30 min，再经液氮速冻2 min，37℃水浴热激5 min，在超净台内加入900 μL YEB液体培养基，置28℃摇床100 r/min慢速震荡复苏培养4-6 h。
复苏后的菌液离心，弃去约800灿上清，余下上清将菌体重悬起，均匀涂布到抗性筛选YEB固体培养基上，培养平板倒置于280C恒温培养箱内避光培养36—48 h。
菌落PCR初步鉴定阳性克隆：用灭菌牙签蘸一点菌落作为模板材料将其溶解在PCR反应体系中，PCR程序中的预变性时间相应延长，使细菌细胞壁裂解释放出核质。
通过比较电泳条带的大小，初步确定是否为阳性克隆。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态的制备
A • 挑取农杆菌单菌落于液体培养基中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜活化
B
• 菌液按1:50的比例转接于50ml新鲜培养基中，振荡培养至OD600为0.4-0.6；
C
• 菌液转移至10 ml的离心管中，冰浴30 min
D
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条 件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发 状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到 植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农 杆菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的T-
E
• 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
F
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 • 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µ l/管，24 h内使用或液氮速冻 后-70 °C保存
G
感受态制备的要点：
OD600：0.4～0.6 OD值超过0.6必须重新活化 当OD达到0.3时，每隔20min测一次OD值。 分光光度计要测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态，有沉淀要 摇匀。注意比色杯的正确选择及使用 光电比色法定量测试原理：朗伯比尔定律：“当一束平行单色光垂直通过某一均 玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。石英玻璃在紫 匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比”。 外线到红外线的整个光谱波段都有较好的透光性能，可见光透过率在９３％以 其中“吸收层厚度”就是实践中的比色杯厚度，如果测试中使用的比色杯不是同 上，特别是在紫外光谱区，最大透过率可达８０以上，而普通的玻璃在紫外光 一套，就无法保证其厚度一致，也就人为导致测试结果出现偏差。 谱区的透过率较差。一般，测定波长在350毫微米以上时，可以用玻璃比色杯；
农杆菌
1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于50ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml（含有抗生素） YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4.（将菌液冰浴30min后）转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
农杆菌感受态细胞的制备(l)将农杆菌接种于5一10mlYEB液体培养基中(Str 100mg/L)，28℃震荡过夜。
(2)取lml活化的菌液接种于50ml含有抗生素的YEB培养基中，同样条件下培养至OD600值为0.4一0.5左右。
(3)将菌液冰浴30min后，装至50ml离心管中。
(4)4℃，5000g离心10min，收集菌体。
(5)弃上清，用lml 20mmol/L的冰预冷CaCl2重悬沉淀，并加入0.5ml，80%的甘油，混匀。
(6)按每管200ul分装，液氮速冻后于一70℃保存。
冻融法转化土壤农杆菌(l)取1ug载体DNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min。
(2)液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min。
(3)加入800ul YEB液体培养基，28℃轻摇4一6hr。
(4)取50一200ul菌液涂布于YEB选择平板上（含有相应的抗生素），28℃倒置培养2天。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。
农杆菌感受态制备
版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。
1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。
再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。
28 C培养到形成单菌落。
其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。
版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。
5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。
实验三农杆菌感受态细胞制备及转化
农杆菌感受态
感受态细胞（competent cell)是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态.
重组DNA要导入宿主细胞，其生理状态很重要，需要将细胞进行特 殊处理，使细胞膜透性发生暂时性改变，成为容易接受外源DNA分 子的状态，即成为感受态细胞。
电击法， CaCl2法。 不同的转化方法需制备不同的感受态。 CaCl2法制备感受态：正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶
农杆菌介导基因转化
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件 下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状 根。
根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植 物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆 菌介导法植物转基因的理论基础。人们将目的基因插入到经过改造的TDNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后 通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 特点：操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
• 4℃，5 000 rpm离心5 min, 弃上清，收集菌体 D E • 菌体重悬于4ml冰预冷的20 mM的CaCl2中，冰浴10-20 min
• 4℃，5 000 rpm离心5 min，弃上清 F
• 菌体重悬于1ml冰预冷的20 mM的CaCl2，分装100µl/管，24 h内使用或液氮速冻 G 后-70 °C保存
感受态细胞制备及转化中出现的问题
感受态长期保存要进行速冻，立即用-80 ℃冰箱或液氮速冻，而在使用 时，用37 ℃水浴或手掌体温进行速融，避免冰晶形成过程对细胞造成的 伤害，导致细胞破损不能存活。 感受态细胞不能反复冻融。 涂板后时间过长会有假阳性转化子的出现，抗生素在37℃过夜后失活， 抗生素作用是抑制未转化的感受态细胞生长，而不能将这些细胞杀死， 所以涂板后无单菌落出现，出现长满板的情况为抗生素失活。
农杆菌感受态制备与转化
双元载体的农杆菌转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.
2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。
4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.
2. 双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min(液氮一分钟)。
再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。
28℃培养到形成单菌落。
其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2溶液可用溶液（0.1MCaCl2
0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。
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农杆菌电击感受态的制备及电击转化
表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化
（1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒
pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。
按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。
（2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。
（3）农杆菌EHA105电击预备处理。
I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。
EHA105
II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。
1.5ml
III. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。
IV. 重复步骤ⅲ三次。
V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。
加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。
（4）电击
I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。
II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。
III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。
IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L 和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。
8000rpm
1.制备农杆菌电转感受态
(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素
100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。
(2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡
3-4小时，至OD560=0.5左右。
(3) 5000rpm离心5分钟，去上清。
(4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min.
(5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。
(6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟，
(7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/
管)备用。
2 农杆菌感受态的电转化
〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴
30分钟。
(2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。
(3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。
(4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培
养基平板上，
28℃培养2-3天。
其实和大肠杆菌电转化差不多，只不过培养温度是28度，摇的时间长一些，还有就是链霉素和利福平两种抗生素要加上，目的是防止根癌脓杆菌自带质粒的丢失，不过具体要加哪些抗生素还得看你是那种根癌脓杆菌非常感谢我用的不是电转化是把茎和叶浸在农杆菌液里30秒..想知道为什么不是把菌液直接滴在土里?可以采用注射法导入农杆菌还有就是把植株取出放入侵染液中用真空渗透法导入
感受态制备及转化
1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV3101
2、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：
1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；
3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；
4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；
5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；
6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；
制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：
1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；
2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；
3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；
4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str。