农杆菌介导的转化方法
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种重要的生物技术手段，被广泛应用于真菌基因工程研究和相关产业生产中。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术利用农杆菌Ti质粒中的T-DNA片段将外源基因导入真菌细胞内，使真菌细胞具有新的遗传特性。
近年来，随着生物技术的发展和研究的深入，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究取得了令人瞩目的进展。
一、根癌农杆菌介导的真菌遗传转化原理及方法1.构建适合真菌的质粒载体，将外源基因插入T-DNA载体中，构建成适合真菌遗传转化的质粒载体。
2.将构建好的质粒载体通过农杆菌进行转化，使其含有T-DNA片段。
3.利用农杆菌与真菌细胞的接触，将质粒中的T-DNA片段导入真菌细胞内。
4.筛选和鉴定转化后的真菌株系，确认外源基因是否成功导入真菌细胞中，并对转化菌株进行鉴定和分离纯化。
根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术在农业生产中有着广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 抗病力提高：根癌农杆菌介导的真菌遗传转化可以实现真菌对病原菌的抗性提高，使植物在生长过程中更加健康，减少病害发生的可能性。
2. 产量增加：通过真菌遗传转化技术可以使真菌获得更好的生长特性和代谢特性，从而提高作物产量。
3. 抗逆性提高：真菌经过遗传改造后，可能对环境中的逆境条件具有更强的抵抗能力，使植物更加适应不良环境的生长条件。
4. 品质改进：真菌遗传转化技术还可以用于改进植物的品质，比如提高农作物的风味、口感等。
1. 药物生产：利用真菌遗传转化技术可以大规模生产生物药物，比如抗生素、激素等，在生物医药领域有着重要的应用。
2. 新药研发：真菌遗传转化技术可以用于研发新的药物，通过改造真菌代谢途径等方式，获得新型的生物活性化合物。
3. 医学研究：真菌遗传转化技术也可以用于医学研究领域，比如用于疾病的基因治疗、蛋白质表达等。
1. 技术改进：研究者不断优化根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术，提高转化效率和稳定性，为真菌的遗传改造提供更好的手段。
根癌农杆菌介导的真菌转化
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根癌农杆菌介导的真菌转化(一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。
2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。
3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。
4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。
5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。
6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。
b电击转化1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。
2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。
3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。
4)于28℃，220rpm，2-3h。
5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。
(二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化petentcells1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃6)Resuspendcellsin1mlof20mmcacl27)Aliquotsinto0.1ml,thenfreezeinliquidnitrogen,andstoreat-80℃bplasmid Transformation1)Thawcompetentcellsonice.2)Add1μgplasmid(5μl)tothecompetentcellsandmixwell.3)Freezeinliquidni trogenfor5min.4)heatshockat37℃for5min.5)Add1mlLbandgrowat28℃for3hrwithshakingat150rpm.6)spreadcellsontoLbplatescontaininganappropriateantibioticandincubate atroomtemperaturefor2-3days.(三）农杆菌介导的真菌转化1将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYeb液体培养基（50μg/mlcar和50μg/mlkana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。
农杆菌介导转化法
它是利用根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌的Ri 质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成 肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并 插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的 遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非 必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获 得稳定的表达。
T-DNA区含选择标记基因＋报告基因
农杆菌介导转化法
转基因植物
一、植物转基因技术
• 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。 它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、 媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得
到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，
从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类
所需要的新品种或新物种。
目的基因的分离和克隆 克隆基因的鉴定与分析
报告基因 选择标记基因
遗传转化预备实验使用载体的T-DNA区
选择标记基因（npt－Ⅱ，hpt）确定选择用抗生素类型，报告基
因（gfp,gus)可以通过快速鉴定，迅速确定材料是否能够表达外源报 告基因，及其统计转化效率，获得最佳诱导因素的梯度，从而优化 目的基因的转化条件，之后进行目的基因转化。 gus基因的表达产物可以与化学试剂发生蓝色反应；gfp基因产物 直接在蓝光下或紫外光下发出绿色荧光。
待改良植物的预处理 受体细胞系统建立
目的基因载体构建
植物细胞的遗传转化 目的基因在受体细胞的整合与表达 转化细胞克隆的筛选 转基因植株的获得与分子鉴定
田间性状鉴定
育成转基因植物新品种
二、植物基因转化方法
（一）外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法（双、单子叶植物） （二）外源基因的直接转化法 物理法诱导DNA直接转化： 基因枪法(单子叶植物 )、显微注射 化学诱导DNA直接转化： PEG(原生质体） （三）花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素1.农杆菌感染：农杆菌通过其特有的类纤毛附着剂蛋白(T4SS)结构与植物细胞进行初步接触和附着。
2. 感染信号传递：在与植物细胞接触后，农杆菌释放并传递一系列感染信号，包括有效异常淋巴细胞(QvrAB)的诱导、拟南芥(Ca2+)离子内涵物的释放、脑心肌炎物质(AHL)的转运和细胞壁酶的活化等。
3.感染信号诱导细胞凋亡：感染信号的诱导会引起植物细胞凋亡，从而产生切伤的部位或孔洞，在这些切伤或孔洞中形成转化DNA理论允许进入的环境。
4.DNA传递：农杆菌通过T4SS释放线性转化DNA，并借助激发剂打开DNA链，并且该辅助剂经常与T-DNA共同转移到植物细胞总群落中。
5. 植物细胞再生：经过切伤或孔洞进入植物细胞的转化DNA在细胞质中被转录，转录本通过RNA splicing进一步处理并通过核孔复合物进入细胞核。
在细胞核中，转录本通过与受体蛋白结合而在柏氏体中形成mRNA。
mRNA会进一步被转录为蛋白质，这些蛋白质会促进植物细胞再生。
1.植物物种：不同植物物种对于农杆菌的感染和转化效率具有差异。
有些植物对农杆菌的感染和转化具有天然的耐受性或敏感性。
2.植物组织类型：不同植物的不同组织对于农杆菌的感染和转化效率也有所差异。
例如，幼嫩的愈伤组织对于农杆菌的感染和转化效率通常较高。
3.农杆菌菌株：不同菌株具有不同的亲和力和感染能力。
有些农杆菌菌株能够高效地感染和转化植物细胞，而有些菌株效率较低。
4.结构改造：农杆菌通过改造表面酶结构以增加其细胞壁附着能力，从而提高农杆菌感染和转化效率。
5.切伤或孔洞大小：适当的切伤或孔洞大小能够促进农杆菌介导植物转化的效率。
切伤或孔洞过小会限制转化DNA进入细胞，而切伤或孔洞过大则会增加细菌感染的难度。
总之，农杆菌介导植物转化是一种复杂的生物学过程，其效率受到多个因素的影响。
进一步研究和优化这些因素可以提高农杆菌介导植物转化的效率，为植物遗传工程提供更多的可能性。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素农杆菌介导植物转化是一种常用的基因转化技术，利用农杆菌转化DNA进入植物细胞，使其表达目的基因。
在这个过程中，农杆菌的外源DNA会被单胞菌分泌物（Vir）基因编码的蛋白质工具分子T-DNA结合酶（VirD2）切割成目标T-DNA片段，然后T-DNA和Vir蛋白质工具分子挤进被切开的植物细胞，最终整合入植物细胞的染色体中。
1.农杆菌菌株：农杆菌菌株的选择对转化效率有重要影响。
通常选择具有较高转化效率的农杆菌菌株，如LBA4404、GV3101等。
不同的菌株对于不同的植物种类和品种可能有不同的适应性，因此需要根据具体情况进行选择。
2.感受性植物：不同植物对农杆菌介导植物转化的感受性各不相同，高度感受性的植物容易进行转化。
除了感受性外，植物的再生能力也是影响转化效率的因素之一、通常来说，拥有较高再生能力的植物对转化更加容易。
3.T-DNA载体：T-DNA载体是构建农杆菌介导植物转化载体的关键。
在农杆菌介导植物转化过程中，目标基因的载体必须经过农杆菌系统与植物细胞进行相应的介导，进而整合到植物细胞基因组中。
选择合适的T-DNA载体进行构建，可以提高转化效率。
此外，T-DNA载体中导入基因的拷贝数、插入位点的选择等也会对转化效率产生影响。
4.辅助物质：除了基础的转化体系以外，辅助物质也是影响转化效率的一个重要因素。
辅助物质主要包括感受性缓解物质、抗生素等。
感受性缓解物质主要用于保护不同类型的植物细胞免受农杆菌侵染造成的伤害，提高细胞存活率；抗生素主要用于抑制农杆菌菌落的生长，避免菌落过度生长对植物细胞的负面影响。
辅助物质的添加可以有效增加转化效率。
5.转化条件：转化温度、菌液浓度、转化时间等转化条件也会对转化效率产生影响。
具体条件需要根据植物种类和品种的特点进行优化。
总之，农杆菌介导植物转化主要是通过农杆菌菌株和植物的相互作用引发变化，其转化效率受多个因素的综合影响。
农杆菌介导的共转化体系的研究进展
1 共转化的研究现状1.1 电激法介导的共转化两个不同的外源基因（其中一个为标记基因）分别构建在两个不同的Ti质粒上。
混合后通过电激法转化原生质体，共转化率为20%-25%，连锁基因的共转化率更高，为50%-100%。
通过电激法已成功地将多基因转入双子叶植物的原生质体，并且共转化率可以与单基因的转化相媲美，但单子叶的电激法共转化相对较难。
1.2 PEG(聚乙二醇)介导的共转化 Leszek A.Lyznik通过PEG介导法成功地将位于不同质粒上的gus基因和nptⅡ基因同时转入玉米的原生质体，得到了大量的共转化的愈伤组织，共转化率为50%。
由于转化率明显受到分离原生质体的方法以及培养条件的影响，其共转化率并不十分稳定。
1.3 基因枪介导的共转化将带有不同外源基因的Ti质粒混合在一起，包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。
这种方法转化的基因数量多，而且效率也高。
Hadi Mz用基因枪将12个质粒同时转化到大豆的胚发生悬浮培养组织中。
多数转基因大豆都带有所有的质粒，并且经常是共整合在基因组的同一位点或相同的位点，因此每种质粒被吸收和整合的概率相同。
不同的研究小组得到的共转化率分别为40%-60%、47%-50%、33%-60%。
连锁基因的共转化率为100%。
通过基因枪得到的转基因苗常常出现多拷贝现象，每个基因可多达10-15个拷贝；转基因植株多数是按孟德尔规律遗传，但有时会出现非孟德尔遗传现象：有时不能将外源基因传给后代，或者传代率很低。
可能是外源基因插入后引起染色体结构不稳定，或者插入到一个对胚珠受精以及发育必需的基因内，从而使遗传异常化。
1.4 农杆菌介导的共转化农杆菌Ti质粒转化系统与其他基因转化体系相比，具有许多突出的优点：①该转化体系是模仿或称之为利用天然的转化载体系统，成功率高，效果好；②农杆菌Ti质粒转化系统的机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最广泛；③农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料；④农杆菌Ti质粒转化系统操作比较容易，需要的仪器设备简单，易于推广。
农杆菌介导的转化方法
第二步 感染植物
农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的 基部）。
第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB… 第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞 核里，整合到植物基因组中。 第五步 诱导冠瘿瘤 T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和 细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
① Ti质粒
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中，诱导双子 叶冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。
根瘤
改造后的Ti质粒载体模式
ori
4
② 农杆菌的感染和生存 第一步:植物受伤
植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香 酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的 毒性基因表达。
农杆菌介导转化法
农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含 有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以 转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增 加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。
④农杆菌转化的方法
1、共培养法
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。
2、叶圆盘法 3、活-integration method
2.叶盘转化法
农杆菌共培养侵染
愈伤组织 分化生芽
生根
3. 活 体 接 种 法
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法的原理
农杆菌转化法是一种利用外源DNA和农杆菌介导的在细胞内表达的方法。
该方法最早由美国生物化学家Herbert Boyer于1973年提出，并于1977年被用于创造第一个基因突变植物。
自此，农杆菌转化技术在分子生物学、分子遗传学、细胞生物学等领域取得了巨大成功，成为近十几年来生物技术发展中最重要的技术之一。
农杆菌转化法的原理是将外源DNA片段植入特定的农杆菌中，然后让农杆菌介导将外源DNA片段植入到宿主细胞中，以达到改变宿主基因的目的。
具体而言，首先需要在细胞中引入一种叫做“质粒”的载体，它可以携带外源DNA片段，然后在细胞中的特定位置，利用农杆菌提供的一些促进基因转移的酶将质粒植入细胞中。
农杆菌转化法为研究植物基因组提供了一种灵活、可靠、快速且高效的方法，可以用来改变植物的遗传特性，控制植物的生长发育状态，以及提高植物的产量和质量。
而且，农杆菌转化技术还可以用来为研究人员提供精确的模型，以更好地理解植物的基因表达和调控机制。
此外，农杆菌转化法还可以用于制造生物材料和医药，以及制造其他用途的产品。
因此，农杆菌转化法在生物技术领域具有重要的应用价值，是生物技术发展中最重要的技术之一。
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❖农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含 有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以 转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增 加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代 。
第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
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④农杆菌转化的方法
1、共培养法
包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养和愈伤组织共培养。
2、叶圆盘法 3、活体接种法
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1.共培养法
The co-integra. tion method
2.叶盘转化法
农杆菌共培养侵染 愈伤组织 分化生芽
生根
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3. 活 体 接 种 法
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第二步 感染植物
农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的 基部）。
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第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB…
第四步 T-DNA转移
T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞 核里，整合到植物基因组中。 第五步 诱导冠瘿瘤
T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细 胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。
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①Ti质粒
存在于能引起植物形成冠瘿瘤的农杆菌中，诱导双子 叶冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。
根瘤 .
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改造后的Ti质粒载体模式
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② 农杆菌的感染和生存
第一步:植物受伤
植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香 酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的 毒性基因表达。