烟草瞬时表达
烟草瞬时表达步骤 电子版
亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀•4℃，13000prm离心15min.•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
烟草瞬时表达
烟草瞬时表达
（1）挑起单个农杆菌菌落，接种到3ml LB液体培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜。
（2）将上述过夜培养菌液在常温，4000r下离心2min，收集菌体。
（3）用渗透培养液( 10 mmol MgCl2 )重新悬浮沉淀的农杆菌细胞（一般需要1~1.5mL渗透培养液）。
调节浓度OD600至0.5~1.0 (可大概估计)。
（4）烟草植株无一定大小要求，一般4~5叶期，已经生长一个月左右的本氏烟比较合适，注射前要充分吸水30min使其气孔张开，然后用1mL的无针头的注射器吸取悬浮有农杆菌的渗透培养液从烟叶背面注入叶片内。
（5）将处理过的烟草放回培养室，照常管理。
（6）制片，观察叶背面荧光表达情况。
[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法
![[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法](https://img.taocdn.com/s3/m/e8c47eb56f1aff00bfd51e41.png)
[植物科学领域]利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法Method for transient expression in vivo by infecting tobacco with Agrobacterium一、原理（Principle）烟草叶片的瞬时表达系统常用来进行基因的亚细胞定位监测，监测蛋白在细胞中分布的位置，从而对其功能进行预测。
通过基因翻译的蛋白与绿色荧光蛋白构成融合蛋白，在激光共聚焦仪器下观测绿色荧光的分布，判断蛋白表达的部位。
同时，还可根据荧光的光强度检测蛋白的表达量。
该过程是经根癌农杆菌介导的，进而将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
Tobacco leaf transient expression systems are often used to monitor the subcellular localization of genes, monitor the distribution of proteins in cells, and predict their function. The gene translated protein and green fluorescent protein constitute a fusion protein. The distribution of green fluorescence is observed under a laser confocal instrument to determine the protein expression site. At the same time, the expression level of the protein can also be detected based on the light intensity of the fluorescence. This process is mediated by Agrobacterium tumefaciens, which integrates the gene of interest into tobacco cells.二、材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. MES: 2-(N-吗啉代)乙磺酸6. 抗生素7. 注射器Materials and reagents1. Agrobacterium strain carrying an expression vector (usually the expression vector is driven by the 35S promoter)2. Tobacco plants for 2-4 weeks3.LB medium4.Acetosyringone5.MES: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid6.Antibiotics7. syringe三、仪器1. 50 ml 离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜Third, the instrument1. 50 ml centrifuge tube2. spectrometer3. UV lamp4. fluorescence microscope四、步骤1. 挑取单克隆于5 ml LB液体培养中，28~30°C震荡培养。
农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究_孙蔓莉 (1)
ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－１３８９．２０１５．０１．０２８
网 络 出 版 日 期 ：２０１５－０１－２０ 网 络 出 版 地 址 ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１２２０．Ｓ．２０１５０１２０．０９２０．００３．ｈｔｍｌ
植物通过２种防御机制响应病原菌的侵染， 一种是识别并响应病原菌特征分子或微生物特征 分子，另一种是直 接 或 间 接 地 响 应 病 原 菌 效 应 因 子 。 ［１２］ 前人在 研 究 亚 麻 对 亚 麻 锈 菌 抗 病 性 的 基 础上，提出 基 因 对 基 因 模 型［１３］，即 当 有 一 对 抗 病 基因和无毒基因 存 在 的 情 况 下，就 可 以 引 发 过 敏 性坏 死 反 应 （Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＨＲ），马 铃薯晚疫病抗病基因 ＲＢ 和致病疫霉菌效应基因 Ａｖｒｂｌｂ １ 互作可引发 ＨＲ［１４］。本研 究 利 用 ＲＢ 和 Ａｖｒｂｌｂ １ 为 报 告 基 因，ＧＵＳ 基 因 为 空 白 对 照，以 本氏烟和６个普 通 烟 草 品 种 为 材 料，采 用 农 杆 菌 介导的注射渗透 法，分 析 烟 草 的 基 因 瞬 时 表 达 的 最佳条件。
本研究分析菌悬液od600值遗传背景烟草品种及其生长时期并对根癌农杆菌介导的烟草基因瞬时表达影响因素进行分析确认od60006和08时agl1gv3101和c58c1农杆菌菌系在本氏烟上介导的瞬时表达rb和avrblb1的效率较高且一致表现在烟草叶片均出现明显的坏死斑对照gus基因未出现坏死现象注射不含菌液成分溶液即注射重悬液mes后不表现任何反应
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因
利用烟草花叶病毒瞬时表达目的基因一、实验目的蛋白瞬时表达方法已被用于烟草当中，例如来定位绿色荧光蛋白等标记物标记的目的蛋白的亚细胞位置，或者在不利用转基因植物的条件下生产和诱导大量蛋白。
可利用基因工程改造后的根癌农杆菌来引导目的基因进入烟草叶中进行表达。
二、实验原理烟草花叶病毒(TMV)表达载体30B是一个目前广泛应用的植物病毒表达载体，但用其生产外源蛋白时，必须先将它体外转录成RNA，才能被用来接种宿主植物。
但RNA体外转录费用昂贵、操作复杂。
用农杆菌接种法(a-groinnoculation)接种该病毒载体，即将30B cDNA 置于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35启动子和终止子之间，再将整个表达框架插人到农杆菌T-DNA的左边界和右边界之内，构建成质粒p35S-30B，将转人该质粒的农杆菌注射到植物的叶片中，30B cDNA随T-DNA进人植物细胞后，被转录成可自我复制的RNA形式，进而发生系统侵染。
为了检测此接种方式的可行性，绿色荧光蛋白(GFP)报告基因被克隆到p35S-30B中，构建成p35S-30B:GFP，用含有该质粒的农杆菌进行注射操作。
三、实验试剂和仪器1. 带有病毒表达载体的农杆菌菌株(通常由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动)2. 健康的烟草(Nicotiana benthamiana)植物(3-4周龄)3. MES / KOH(pH=5.6)4. 氯化镁5. 乙酰丁香酮6. 相应抗性的LB培养基四、实验步骤1、准备激活缓冲液配制母液MgCl2 1 M; MES (pH 5.6) 100 mM; 乙酰丁香酮(Ace)100 mM。
使用时，每1 ml 溶液中加入888 μl无菌水，10 μl MgCl2 1 M，100 μl MES (pH 5.6) 100 mM，2 μl乙酰丁香酮(Ace) 100 mM。
2、挑克隆挑取重组农杆菌单斑接种于含有Kan (50 mg/l) 和Rif (50 mg/l) 抗性的LB 培养基中28℃过夜振荡培养；然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，经6000 rpm离心5 min收集菌体3、制备菌液用含终浓度为10 mM MgCl2，10 mM MES (pH=5.6)，200 μM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至OD600=0.5或者根据需要调整；在室温下放置3 h以上。
烟草瞬时转化之欧阳文创编
本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、二、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.710nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会。
烟草瞬时表达原理
烟草瞬时表达原理烟草瞬时表达原理是指烟草植株在生长发育过程中，通过信号传导途径，调控基因表达和代谢途径，从而快速响应外界环境变化，实现瞬时适应和生存优势的一种生理机制。
烟草植株在面对环境胁迫、病虫害和营养物质供应等外界压力时，能够快速调整生长发育和代谢途径，以适应环境变化，保证植株的生存和繁衍。
烟草瞬时表达原理的核心是信号传导途径。
烟草植株通过感知外界环境信号，如光照、温度、湿度、营养物质浓度等，启动内部信号传导途径，进而调控基因表达和代谢途径。
这一过程涉及多种信号分子和信号通路的参与，包括激素信号、离子信号、氧化还原信号等。
这些信号分子在植物体内形成复杂的信号网络，通过相互作用和调控，最终影响基因表达和代谢途径的调控。
烟草瞬时表达原理的实现依赖于基因表达和代谢途径的调控。
烟草植株在面对外界环境变化时，会启动特定的基因表达途径，调控相关基因的表达水平，以实现对环境的快速适应。
同时，烟草植株还会调整代谢途径，重新分配营养物质和能量，以满足生长发育和抵御外界压力的需要。
这些调控过程涉及到多种基因和代谢产物的参与，形成复杂的调控网络。
烟草瞬时表达原理的研究对于揭示植物生理机制、改良烟草品种、提高烟草产量和质量具有重要意义。
通过深入研究烟草瞬时表达原理，可以发掘植物在面对环境胁迫时的生理适应机制，为培育抗逆烟草品种提供理论依据和实践指导。
同时，还可以通过调控烟草瞬时表达原理，提高烟草产量和品质，促进烟草产业的可持续发展。
总之，烟草瞬时表达原理是烟草植株在面对外界环境变化时的一种生理适应机制，涉及信号传导途径、基因表达和代谢途径的调控。
通过深入研究和理解烟草瞬时表达原理，可以为烟草品种改良和产业发展提供重要的理论和实践支持。
不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性
列 的１ ． ５ 倍： Ｕ ｂ ｉ ． Ｕ ４ ． Ｃ ａ Ｍ Ｖ ３ ５ Ｓ 复合启动 子附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列驱动 ＧＵ Ｓ 基因表达水平 最高 ， 其表 达效 率是双Ｃ ａ Ｍ Ｖ ３ ５ Ｓ 启动子 附
￣Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列调控 下 ＧＵＳ 表达效率 的３ 倍， 为Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ 独 立作用 时的 １ ０ 倍。
维普资讯
植 物学通报 Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｂ ｕ ｌ ｌ ｅ ｔ ｉ ｎ ｏ ｆ Ｂ ｏ ｔ ａ ｎ ｙ ２ ０ ０ ７ ， ２ ４（ ４ ） ： ４ ５ ２ － ４ ５ ８ ， ｗ ｗ ｗ ・ ｃ ｈ ｉ ｎ ｂ ｕ ｌ ｌ ｂ ｏ ｔ ａ ｎ ｙ ・ ｃ ｏ ｍ
通过 叶盘转化法转 化烟草 叶片， 检测 瞬时表达 活性 ， 研 究不 同调控序列 对外源基 因表达 的调控 作用 。结 果表 明： Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ 启 动子 附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列后使 ＧＵ Ｓ 活性 比独立使 用Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ提高 了近２ 倍： ￣Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ 启 动子附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列 驱动 ＧＵＳ 基 因的 表达 活性与单 Ｃ ａ ＭＶ ３ ５ Ｓ附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序 列相当 ： 烟草 泛素启动 子附￣ Ｈ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序列 的表达活性 为Ｃａ ＭＶ ３ ５ Ｓ 启 动子 附￣ ｎ Ｋ ｏ ｚ ａ ｋ 序