烟草瞬时表达步骤 电子版
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究文莉薇;朱鸿亮【期刊名称】《植物学研究》【年(卷),期】2015(004)002【摘要】本研究以GUS基因和RIN基因作为报告基因,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101对烟草叶片注射侵染,探究了农杆菌侵染浓度对本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达效果的影响,建立并优化了烟草中的瞬时表达体系。
结果表明,β-葡萄糖苷酶(GUS β-glucuronidase)基因与RIN基因在OD600 = 1.0的侵染浓度时表达效果最佳。
农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达方法简单高效,结果准确可靠,从种子播种到收获蛋白只需25天左右。
该体系的建立与优化为基因表达和蛋白功能性研究等方面提供了一定支持。
【总页数】7页(P25-31)【作者】文莉薇;朱鸿亮【作者单位】[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京;;[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京【正文语种】中文【中图分类】S5【相关文献】1.农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究 [J], 陈思涵;钱靖;彭杰军;鲁宇文;郑红英;林林;燕飞;陈剑平2.去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达 [J], 常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉3.烟草基因组计划进展篇：6.烟草全基因组过量表达和RNA干涉体系的建立与应用 [J], 路铁刚4.棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 [J], 李妮娜;丁林云;张志远;郭旺珍5.杜氏盐藻番茄红素ε-环化酶基因DsLYCE表达载体构建及其在烟草中瞬时表达分析 [J], 王计平; 安茜; 段露露; 赵熙宁; 岳敏; 崔红利; 李润植因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀•4℃，13000prm离心15min.•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)
利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)雒丽娜;王盛【摘要】构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA (Reteplase)的烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus,TMV)瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)中进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(western blotting)和纤维蛋白琼脂糖平板(fibrin-agarose plate assay,FAPA)法检测分析.结果表明,在烟草中成功地表达出了有活性的rPA.为在植物中生产Reteplase提供了一条可能的途径.%Tobacco Mosaic Virus RNA-based transient expression vectors containing the truncated Human Tissue Plasminogen Activator (Reteplase) was constructed and transformed into Agrobacterium GV3101. The recombinant Agrobacteria were delivered into tobacco plants (Nicotiana benthamiana) by means of an Agrobacterium-mediated transient transformation assay. The efficiency was evaluated by SDS-PAGE, western blotting and Fibrin-agarose plate assay (FAPA). Those results showed that bio-active rPA was successfully expressed in the tobacco leaves and proposed that the plant virus RNA-based expression system will be a useful tool for expressing Reteplase in plants for production purposes.【期刊名称】《宁夏大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(033)001【总页数】4页(P58-61)【关键词】人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA(Reteplase);烟草花叶病毒;瞬时表达载体【作者】雒丽娜;王盛【作者单位】宁夏大学生命科学学院,宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,宁夏银川 750021【正文语种】中文【中图分类】S432.41急性心肌梗死、脑梗死等血栓、栓塞性疾病的致残率和致死率都很高，严重威胁着人类健康及生命［1］.临床上，以溶血栓为主的溶栓药物疗法是治疗血栓疾病的主要方法，其作用机理是通过激活无活性的纤溶酶原转变成纤溶酶，催化血栓主要基质纤维蛋白水解，使血管再通［2］.重组的rPA（Reteplase）是临床上治疗血栓性疾病的常用药物［3］，是在人组织纤溶酶原激活剂（human tissue type plasminogen activator，t－PA）基因基础上，通过人工缺失获得基因后，再进行表达的基因工程产品，具有半衰期长、溶栓作用强、对纤维蛋白选择性高、副作用小等优点［4］.商品化的rPA药物是经由大肠杆菌表达系统获得的，非糖基化，产量较低，后续复性纯化的收率不高，价格昂贵（一个疗程需要8 000～10 000美元）.因此，探索和研究新型、高效的表达系统，是提高产量、降低成本的关键.近年来，研究人员先后在CHO细胞（chinese hamster ovary cell）［5］、酵母［6］、转基因动物乳腺［7］、昆虫细胞［8］、转基因植物［9—11］、利什曼原虫［12］和海藻［13］等表达体系中表达t－PA获得成功.但这些表达体系仍存在表达效率低、费用高、生产工艺繁琐和周期长等问题［14］.利用植物RNA病毒瞬时表达载体表达外源蛋白是近年发展起来的，具有表达量大、速度快和廉价等优势的一种新型外源蛋白表达方式［15］.与其他表达系统相比，植物病毒载体表达体系在短时间内、不影响环境的条件下，可以生产大量成本低廉、安全的目的蛋白，这是目前其他任何一个表达系统都不可能实现的，而且这些特点也恰好符合低成本rPA生产的需求.基于此，笔者构建了重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA（Reteplase）基因的烟草花叶病毒表达载体PJL TRBO－rPA，并在烟草中进行了表达研究和初步分析.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株和试剂大肠杆菌（Escherich coli）DH5α菌株（保存于宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室）；质粒小提试剂盒、Protein Marker、1Kb Plus DNA Ladder Marker、DL2 000Marker、DL15 000Marker、Pfu DNA Polymerase Mix（天根生化科技（北京）有限公司）；预染Protein Marker、平末端克隆载体pEASYBlunt Simple Cloning Kit（全式金（北京）有限公司）；限制性内切酶PacⅠ和NotⅠ（纽英伦（NEB）生物技术北京有限公司）；T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司）；卡那霉素（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；NC膜（宝生物工程（大连）有限公司）；rPA标准样（爱德药业（北京）有限公司）；ε－氨基己酸（EACA）（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；rPA抗体（英国abcam公司）；羊抗兔Ig G－HRP、HRP－DAB底物显色试剂盒（博士德（武汉）有限公司）；牛纤维蛋白原（牛血）、纤维蛋白溶酶原（牛血）和凝血酶（中国药品生物制品鉴定所）；其他试剂均为进口或国产分析纯.1.1.2 质粒和载体 rPA－C9质粒（宁夏大学李敏教授提供）；PJL TRBO－G载体（美国俄亥俄州立大学John A.Lindbo博士惠赠）.1.1.3 植物材料烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）种子（中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所张永江博士提供）.1.2 方法1.2.1 引物设计根据GenBank（M15518.1）报道的t－PA序列，利用DNAMAN 5.0软件设计引物.上、下游引物分别带有PacⅠ和NotⅠ限制性内切酶酶切位点.上游引物Prpaf：5’－GGCGCCTTAATTAAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGAC－3’，下游引物Prpar：5’－ATAGTTTAGCGGCCGCCCTAGGTTACGGTCGCATGTTGTC－3’（下划线为相应的酶切位点）.引物由生工生物工程（上海）有限公司合成.1.2.2 质粒的提取及目的基因的扩增按质粒小提试剂盒说明书提供的方法提取质粒rPA－C9并做模板，以引物Prpaf和Prpar扩增rPA基因片段.PCR扩增体系为25μL，其中含：0.25μL的Pfu DNA polymerase（2.5U／μL）、引物（20mol／L）各1μL、12.5μL的Pfu Mix（2.5mmol／L）、1.0μL模板DNA、9.25μL的去离子H2O.扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环.取5.0μL的PCR扩增产物以w＝1.0%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定.1.2.3 目的基因的pEASY－Blunt克隆大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化均按参考文献［16］中的方法进行.利用DNA回收试剂盒，对剩余的20μL PCR扩增产物进行回收、纯化.目的条带用平末端克隆载体pEASY－Blunt Simple进行15min快速连接，连接产物以氯化钙法转化感受态DH5α大肠杆菌.取100μL菌液涂布于含ρ＝50μg／mL卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养.挑取白色菌落，利用菌落PCR技术进行筛选并送生工生物工程（上海）有限公司对目的片段序列进行序列测定.1.2.4 烟草花叶病毒瞬时表达载体的构建以限制性核酸内切酶PacⅠ和NotⅠ双酶切烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G和克隆载体pEASY－rPA的质粒DNA，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带并分别回收酶切片段；将回收的载体和基因片段按比例混合，用T4DNA连接酶于4℃连接过夜.将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养.小提质粒后用限制性内切酶PacⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定.1.2.5 农杆菌的转化参照文献［16］的方法进行电转化.1.2.6 烟草的接种方法将含目的载体的重组农杆菌菌株于LB液体培养基（含有50mg／L Kan、50mg／L Gent、50mg／L Rif）中28℃、200r／min，暗处振荡培养16～18h；将V（菌）∶V（液）＝1∶25转接入IM培养基中28℃振荡培养至A600约为1.0，离心收集农杆菌；等体积重悬（10mmol／L MgCl2，10mmol／L MES），再次离心收集菌体，等体积重悬（10mmol／L MgCl2，10mmol／L MES，200mmol／L AS），室温暗处静止2～3h后即可接种.用无针头的1mL无菌注射器将含目标载体农杆菌悬浮液压入叶片背面.1.2.7 烟草叶片蛋白的提取接种后第6天摘取植物叶片，以渗滤接种点为中心打孔取样并称鲜质量.叶片样品经液氮充分研碎后，用提取缓冲液（50mmol／L Tris－HCl，5mmol／L EDTA，100mmol／L Nacl，20%甘油，0.1%Tween－20，pH＝8.8）浸提、12 000r／min离心后吸取上层清液进行以下相关测定.1.2.8 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳按文献［16］的方法进行，w（分离胶）＝12%.1.2.9 免疫印迹检测按文献［16］中的方法进行.一抗按1∶5 000稀释，二抗按1∶500稀释.1.2.10 体外纤溶活性的检测按《中国药典》（2010版）中的方法进行.平板每孔加样2μL，同时以加入纤溶酶抑制剂ε－氨基己酸（EACA）的平板作为阴性对照.37℃湿盒放置反应24h后，用考马斯亮蓝对平板进行染色和脱色并观察记录结果.2 结果与分析2.1 目的基因的扩增与序列测定以质粒rPA－C9做模板，以Prpaf和Prpar为引物进行PCR反应，得到约1.0kb 的特异性扩增带，与预期相大小相符（图1）.将此PCR产物回收纯化后，连接到克隆载体pEASY－Blunt Simple上得到重组质粒，命名为pEASY－rPA.以上、下游引物进行PCR扩增，进一步证实了目的基因rPA已经插入到pEASYBlunt克隆载体中（图2）.测序结果经序列拼接和载体序列去除后，获得长度为1 173bp的序列，且序列比对结果与GenBank（M15518.1）中报道的一致.图1 PCR扩增rPA基因的电泳图谱M—DL 2 000Marker；1—PCR扩增获得的rPA基因；2—阳性对照；3—阴性对照图2 rPA基因pEASY－Blunt克隆的PCR菌落鉴定的电泳图谱M—DL 2000Marker；1—阳性对照；2—阴性对照；3～5—PCR扩增产物2.2 TMV病毒表达载体PJL TRBO－rPA的构建烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G和克隆载体pEASY－rPA用限制性核酸内切酶PacⅠ和NotⅠ进行酶切（图3），电泳后分别回收酶切片段.通过连接反应将目的片段插入烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G中，替代PJL TRBO －G中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因.连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养.抽提质粒后用PacⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳显示两条带，分别为10.6kb及1.0kb（图4），与预期的大小相符，说明rPA基因已成功插入到烟草花叶病毒瞬时表达载体PJL TRBO－G中，重组质粒命名为PJL TRBO－rPA.图3 PJL TRBO－G和pEASY－rPA质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切电泳图谱M1—DL15 000Marker；M2—DL2 000Marker；1—PJL TRBO－G质粒；2—PJLTRBO－G质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；3—pEASY－rPA质粒；4—pEASY －rPA质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；5—pEASY空质粒；6—rPA质粒PCR产物图4 PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ和NotⅠ单、双酶切鉴定电泳图谱M—1kb Plus DNA Ladder Marker；1—PJL TRBO－G质粒；2—rPA质粒PCR产物；3—PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ单酶切产物；4—PJL TRBO－rPA重组质粒NotⅠ单酶切产物；5—PJL TRBO－rPA重组质粒PacⅠ和NotⅠ双酶切产物；6—PJL TRBO－rPA重组质粒2.3 rPA在烟草中的表达分析取健康烟草叶片及接种PJL TRBO－rPA载体6d的烟草叶片，分别用蛋白提取缓冲液提取蛋白.所得样品与rPA标准样同步进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS －PAGE）（图5）.结果表明，与健康烟草相比，接种PJL TRBO－rPA载体的烟草叶片总蛋白提取物在40kDa处未见明显的差异条带（图5中的H，1泳道）；在33，28，24kDa处存在3条明显的差异条带.已知rPA在其氨基酸序列的第275／276和423／424间存在2个蛋白酶切割位点，因此推测rPA在烟草中获得了表达，但是表达产物发生了部分降解.图5 rPA在烟草中表达的SDS－PAGE电泳分析M—Protein Marker；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品为了进一步验证上述推测，对上述样品做了免疫印迹（western blotting）检测分析（图6）.结果表明，表达样品在39，33，28，24kDa处存在杂交条带（图6中1泳道），而健康对照样品在相应位置不存在条带（图6中，H泳道条带为上样量较大时Rubisco大亚基形成的非特异性条带）；同时标准样品在相应的位置也有杂交条带产生.说明rPA在烟草中获得了表达且由于表达产物的不稳定，发生了部分降解.图6 rPA在烟草中表达的western blotting检测结果M—预染Protein Marker；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品2.4 rPA活性的纤维蛋白琼脂平板（FAPA）检测在处理好的纤维蛋白平板上加样，各孔均上样2μL，37℃培养24h.活性检测表明，表达样品与标准样品具有体外溶栓活性，而空白对照和健康对照均未发现有活性（图7中EACA（－））.同时，含纤溶酶抑制剂的纤维蛋白平板各样品为没有活性反应（图7中EACA（＋））.该结果进一步证明rPA基因在烟草中获得了表达，且表达产物具有生物学活性.图7 体外纤溶活性的检测Mock—阴性对照；H—健康烟草可溶性总蛋白；1—接种PJL TRBO－rPA载体6d后烟草可溶性总蛋白；2—rPA标准样品3 讨论目前，利用植物生产的药用蛋白或多肽正在逐年增加，该实验也利用烟草花叶病毒表达载体在植物中对rPA（Reteplase）进行了表达研究.结果表明，在烟草中获得了有纤溶活性的rPA重组蛋白，证明了利用植物作为生物反应器生产rPA的可行性.研究中发现，利用植物表达的重组rPA与大肠杆菌表达系统表达的rPA标准样品在相对分子质量上略有差异（图6中1，2泳道），但FAPA验证了二者均具有体外纤溶活性（图7）.分析相对分子质量差异的原因，可能是由于天然的组织型纤溶酶原激活剂自身具有2个糖基化位点，在利用植物体系表达的rPA表达后进行了糖基化的修饰而原核表达的rPA不存在这种修饰，因此造成两者之间在相对分子质量和电泳行为上的差异.此外，利用植物表达的重组rPA中大部分表达产物发生了降解，严重地影响了表达的最终产量.如何进一步避免表达产物的降解，提高系统的表达效率就成为下一步需要重点解决的问题.该研究初步建立了利用烟草花叶病毒表达载体在烟草中瞬时表达重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA（Reteplase）基因的体系，为在植物中生产rPA提供了一条可能的途径，同时对深入了解植物RNA病毒载体表达系统和指导其他具有商业价值的外源基因表达奠定了基础.参考文献：［1］ LLOYD－JONGES D，ADAMS R J，BROWN T M，et al.Heart disease and stroke statistics－2010update：a report from the American Heart Association［J］.Circulation，2010，121（7）：46－215.［2］ ALBRIGHR K，MARTIN－SCHILD S，MORALES M，et ment on US geographic distribution of recombinant tissue plasminogen activator use by hospitals for acute ischemic stroke［J］.Stroke，2009，40（11）：3580－3584.［3］刘晓宇，王憬惺.Reteplase－第3代基因重组纤溶酶原激活物［J］.中国输血杂志，2000，13（2）：1287－130.［4］ GRUNWALD I Q，WAKHLOO A 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烟草瞬时转化
本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：之老阳三干创作二、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步伐：1、根据实验需要, 将所要表达的基因克隆到含有分歧标签的双元载体中, 并转化农杆菌.2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃, 200rpm过夜.*估算时间, 防止农杆菌液浓度超越1OD, 否则会影响转化效率.3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时, 1000g, 5min离心收集农杆菌.4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌, 然后再次离心收集菌液.5、重复步伐4.6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬.7、室温放置1~4小时8、测OD值, 根据实验需要, 配置侵染液（组合详见下文）.9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周年夜的本氏烟草叶片中.*使用注射器时注意平安, 防止针头扎得手, 使用完的注射器要把针头套套上再扔, 或者将针头放到注射器里面, 防止伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套, 防止交叉污染.B、试剂：Induction medium：10nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌, 4℃保管, 用时稀释100倍. 1M MgCl2过滤灭菌, 4℃保管, 用时稀释100倍.0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌, 分装（防止反复冻融）, -20℃.用高压灭菌的超纯水稀释.C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中卵白的表达可以维持比力长的时间, 一般注射24小时之后到一周之内城市有表达.严格来讲需要摸索每个卵白的最佳表达时段, 但一般注射后48小时至72小时分歧卵白表达量都比力可观, 不要错过.D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间.过高的农杆菌浓度会引起叶。
农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化
农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化吴英杰;姜波;张岩;李彦邦;贺琳;王玉成【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2010(038)009【摘要】以烟草叶片为试材,用转入植物表达载体pBI121的根癌农杆菌EHA105进行遗传转化.通过分析菌液不同浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度及共培养时间对GUS基因表达的影响,研究其瞬时表达的最佳条件.结果显示:用OD600值为0.6的农杆菌侵染6 min,在培养基中添加120 μmol·L-1的乙酰丁香酮,共培养2 d,能够得到高效的GUS基因瞬时表达.【总页数】3页(P110-112)【作者】吴英杰;姜波;张岩;李彦邦;贺琳;王玉成【作者单位】林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】Q786;S572【相关文献】1.农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究 [J], 陈思涵;钱靖;彭杰军;鲁宇文;郑红英;林林;燕飞;陈剑平2.农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究 [J], 孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星3.农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究 [J], 孙蔓莉;孟玉玲;张强;黄桂艳;单卫星4.月季花瓣中农杆菌介导的基因瞬时表达体系的优化及其在RNAi中的应用 [J], 王磊;陈雯;刘娅;杨若韵;阴霞;马男;高俊平5.农杆菌介导的pCB302-3载体在本氏烟中瞬时表达条件优化 [J], 孙春莲;王洪洋;田振东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
烟草转化方案
利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。
同时，还可以检测蛋白的表达量。
这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。
通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。
2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。
3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。
4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。
5. 室温放置2-3h后注射烟草。
6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。
注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。
8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。
同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。
配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。
2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。
3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。
5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。
利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA(Reteplase)
１ 材料 和方 法
１１ 材料 ．
１ １ １ 菌株 和 试 剂 大 肠 杆 菌 （ ｓｈ ｒｃ ｏｉ ． ． Ｅ ｃ ｅｉ ｃｌ） ｈ
ＤＨ５ ａ菌 株 （ 保存 于宁 夏 大学 西 部 特 色生 物 资 源 保 护与 利 用 教 育 部 重 点 实 验 室 ） 质 粒 小 提 试 剂 盒 、 ；
２ １ 年 ３月 ０２
Ｍ ａ ． １２ ｒ ２Ｏ
文 章 编 号 ： ２ ３ ２ ２ （ ０ ２ ０ — ０ ８０ ０ ５ —３ ８ ２ １ ） １０ ５ —４
利用 Ｔ ＭＶ病毒载体 在烟草中瞬时表达 Ｐ Ｒ ｔｐａｅ ｒ Ａ（ ｅ ｌｓ） ｅ
雒 丽 娜 王 盛 ， ，
（１ 宁 夏 大 学 生 命 科 学 学 院 ，宁夏 银 川 ７ ０ ２ ； ． ５０ １ ２ 宁 夏 大 学 西 部 特 色生 物 资 源保 护 与利 用教 育部 重点 实验 室 ， 夏 银 川 ７０ ２ ） ． 宁 ５ ０ １ 摘 要 ： 建 了携 带 有 人 组 织 型 纤 溶 酶 原 激 活 剂 突 变体 ｒ Ａ（ ｅｅｌｓ） 烟 草 花 叶 病 毒 （ ｏａ ｃ ｓｉ Ｖ ｒ 构 Ｐ Ｒ ｔｐａｅ 的 Ｔ ｂｃｏＭｏａｃ ｉ“ ， ＴＭＶ） 时表 达 载 体 Ｐ Ｌ Ｔ Ｂ －Ｐ 并转 入 农 杆 菌 ＧＶ １ １中． 用 农 杆 茵渗 滤接 种技 术 在 烟 草 本 氏 烟 （ ｃｔ 瞬 Ｊ Ｒ Ｏ ｒ Ａ， ３０ 利 Ｎｉ ｉ ｏ— ａ ａｂｎｈ ｍｉｎ ） ｉ ｅ ｒ ｔａ ａ ａ 中进 行 表 达． Ｓ － 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳（ ＤＳＰ ＧＥ 、 疫 印 迹 （ ｅｔｒ ｌｔｎ ） 纤 维 蛋 白 经 ＤＳ聚 Ｓ －Ａ ）免 ｗ ｓｅｎｂｏｔ ｇ 和 ｉ 琼 脂糖 平板 （ｉｒ －ｇ ｒｓ ｌ ｅａｓｙ Ｆ Ｐ 法检 测 分 析 ． 果表 明 ， 烟 草 中成 功 地 表 达 出 了有 活 性 的 ｒ Ａ． ｆ ｉ ａ ａｏｅｐａ ｓａ ， Ａ Ａ） ｂｎ ｔ 结 在 Ｐ 为 在 植 物 中生 产 Ｒ ｔｐａｅ 供 了一 条 可 能 的途 径 ． ｅｅｌｓ 提 关 键词 ： 组 织 型 纤 溶 酶 原 激 活 剂 突 变 体 ｒＡ（ ｅｅｌｓ）烟 草 花 叶病 毒 ； 时表 达载 体 人 Ｐ Ｒ ｔｐａｅ ； 瞬
烟草瞬时表达
烟草瞬时表达
（1）挑起单个农杆菌菌落，接种到3ml LB液体培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜。
（2）将上述过夜培养菌液在常温，4000r下离心2min，收集菌体。
（3）用渗透培养液( 10 mmol MgCl2 )重新悬浮沉淀的农杆菌细胞（一般需要1~1.5mL渗透培养液）。
调节浓度OD600至0.5~1.0 (可大概估计)。
（4）烟草植株无一定大小要求，一般4~5叶期，已经生长一个月左右的本氏烟比较合适，注射前要充分吸水30min使其气孔张开，然后用1mL的无针头的注射器吸取悬浮有农杆菌的渗透培养液从烟叶背面注入叶片内。
（5）将处理过的烟草放回培养室，照常管理。
（6）制片，观察叶背面荧光表达情况。
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亚细胞定位准备(用烟草ck)
MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）
1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇
床20h至第四天早上；
2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床
培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；
4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，
室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；
5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h（0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析
所用试剂：
1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）
1M Na2PO4 11.54ml
1M NaH2PO4 8.46ml
Add ddH2O TO 200ml
2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)
0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml
10% SDS 2ml
0.5M EDTA(Ph8.0) 4ml
Tritonx-100 200ul
β-巯基乙醇 200ul
add ddH2O TO 200ml
121℃灭菌室温保存
3、gus蛋白分析buffer
每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）
•取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中•预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀
•4℃，13000prm离心15min.
•吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）
Gus活性测定
•取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
•20min,30min,40min,50min各取50ul加入950uL的0.2M Na2CO3 buffer中终止反应（注意设置重复）
•样品转入酶标板上，使用酶标仪检测荧光强度（x 365nm/455nm）
180ul x
蛋白标准曲线 y=0.0022x+0.3620(R2=0.9966)
标准蛋白 BSA（牛血清蛋白）0.22mg/ml 中科瑞泰，考马斯亮蓝G-250
gus 蛋白提取方法（全过程于冰上操作）
1、取圆叶3片，加液氮研磨成粉末，装入1.5ml离心管中（4个重复）
2、预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，置冰上
3、4℃ 1300rpm离心15Min
4、吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）
gus活性测定
1、取20ul蛋白加入37℃预热的180ul gus 蛋白分析buffer中，37℃温预
2、20min,30min,40min(郭东老师建议),50min 各取20ul（200ul）加入950ul(800ul)的0.2M Na2CO3 buffer终止反应（注意设置重复）
3、样品转入酶标板上，使用promega酶标仪检测荧光强度（x365nm/455nm）
180ul
蛋白标准曲线 y=0.0022x+0.3620(R2=0.9966)
蛋白标准曲线的绘制
标准蛋白 BSA 0.22mg/ml 中科泰瑞考马斯亮蓝G-250
1、考马斯亮蓝染色使用前应平衡温度至室温并颠倒混匀，预热分光光度计
2、将0,10,30,50,70,90，100ulBSA标准溶液分别加入到7支1.5ml 离心管中，加入ddH2O补只到100ul
BSA体积（ul） ddH2O体积（ul） BSA浓度（ug/ml）0 100 0
10 90 22
30 70 66
50 50 110
70 30 154
90 10 198
100 0 220
3、将5-10ul的蛋白样品加到1.5ml离心管中，用ddH2O补足到50ul（用于测定样品蛋白浓度）
4、向各管中加入500ul的考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5-10min
5、用光度计测定595nm处的吸光值，并记录读数，以不含BSA的样品的吸光值做为空白对照
6、绘制标准曲线计算样品中的蛋白浓度，如果所得的蛋白浓度不在标准曲线范围内，稀释样品，重测。
MU标准曲线的绘制
先配置4MU 20mM,稀释（用Na2CO3）200倍到100uM,再稀释100倍到1uM，用于制作标准曲线
4MU体积（ul）0.2M Na2CO3 4MU浓度
0 500 0
10 490 20
20 480 40
30 470 60
40 460 80
50 450 100。