烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（PES）是一种用于在植物中快速、高效地表达外源蛋白的技术。
它是基因工程领域中非常重要的工具，被广泛应用于植物基因功能研究、植物生物工程以及植物疫苗和药物生产等方面。
在过去的几十年里，关于植物瞬时表达系统的研究取得了许多重要的进展，这些进展在优化表达系统、提高表达效率、缩短表达时间和拓展应用领域等方面具有重要意义。
本文将介绍植物瞬时表达系统的基本原理、研究进展以及未来的发展方向。
一、植物瞬时表达系统的原理植物瞬时表达系统是利用几种不同类型的病毒或细菌，如农杆菌（Agrobacterium），烟草花叶病毒（TMV）和土壤细菌等，将外源基因导入植物细胞中，并在短时间内表达出目的蛋白。
基本的操作流程包括：将外源基因插入载体中，然后将载体转化到病毒或细菌中，最后通过侵染或注射等方式将这些病毒或细菌导入植物细胞内，从而实现外源基因的表达。
相比于转基因植物技术，植物瞬时表达系统具有表达时间短、转化效率高、不易产生突变和遗传稳定等优点。
它在植物基因功能研究和植物疫苗、药物等生产方面有着广阔的应用前景。
二、研究进展1. 优化表达系统随着对病毒和细菌基因工程技术的深入研究，人们不断优化植物瞬时表达系统，以提高表达效率和稳定性。
研究人员对载体和表达引物进行了优化，选择了更加适合植物转化的载体和引物，使得外源基因在植物中的表达更加高效和稳定。
病毒和细菌基因工程技术的进步也为植物瞬时表达系统的优化提供了更多可能性，不断地推动着这一技术的发展。
2. 提高表达效率为了提高表达效率，研究人员采用了各种策略，如优化表达条件、改进载体构建和转化方法、筛选适合的宿主植物等。
利用基因组学、蛋白组学等高通量技术，对植物瞬时表达系统进行了深入研究，揭示了植物基因表达调控的机制，为提高表达效率提供了理论基础。
3. 缩短表达时间在研究过程中，人们发现植物瞬时表达系统与传统的转基因技术相比，具有表达时间短的优势。
烟草瞬时表达实验原理
烟草瞬时表达实验原理利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。
在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。
BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。
如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。
试剂：500 mM MES (pH5.6)、100 mM MgCl2、100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、LB 培养基、50 mg/mL Kana (母液)、25 mg/mL Rif (母液)、100 mg/mL Amp (母液)。
仪器：一次性注射器、恒温摇床、分光光度计、普通离心机、激光共聚焦显微镜。
配方：500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。
100 mM 乙酰丁香酮：称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体
利用烟草和豌豆瞬时表达抗aFGF单链抗体单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)是利用DNA重组技术和蛋白质工程技术合成的一种小分子基因工程抗体,最近在肿瘤的诊断和治疗上得到广泛应用。
本研究利用改造的植物病毒载体在烟草(Nicotiana benthamiana)和豌豆(Pisum sativum L.)中瞬时表达抗人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,a FGF)的单链抗体,旨在建立一种安全、高效,易于规模化生产的单链抗体瞬时表达体系。
本研究首先利用基于烟草花叶病毒(TMV)的p35S-30B表达载体,建立烟草瞬时表达体系并表达抗a FGF单链抗体,验证sc Fv在植物中表达的可行性;接着利用基于豌豆早褐病毒(PEBV)的p CAPE1和p CAPE2-GFP载体建立豌豆瞬时表达体系,通过叶片注射法在豌豆中瞬时表达sc Fv,寻找更适于sc Fv表达的受体植物;最后建立一种基于豌豆芽苗菜无土栽培的规模化植物瞬时表达系统,并对该系统表达的sc Fv进行纯化及生物学活性分析。
本研究的主要结论:(1)利用p35S-30B-GFP载体建立了基于叶片注射法的烟草瞬时表达体系,绿色荧光蛋白(GFP)在病毒侵染后8-10天达到峰值;利用含p35S-30B-sc Fv重组质粒的农杆菌EHA105侵染烟草,瞬时表达的sc Fv具有较强的抗原结合能力。
(2)利用p CAPE1和p CAPE2-GFP载体通过叶片注射法建立了豌豆瞬时表达体系,病毒侵染后的10-12天GFP达到最大量累积;成功构建了p CAPE2-sc Fv 和p CAPE2-GFP-sc Fv瞬时表达载体,利用叶片注射法侵染豌豆后,分别在RNA 和蛋白水平上检测到sc Fv基因的表达,ELISA检测证明sc Fv和GFP-sc Fv与抗原具有较好的结合能力。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统是一种基因表达调控技术，旨在实现在植物细胞内迅速高效地表达外源基因。
近年来，该技术在农业、生物医学和生物工程领域取得了显著的研究进展。
本文将从瞬时表达系统的工作原理、应用领域及未来发展方向等方面，对该技术的研究进展进行综述。
植物瞬时表达系统利用病毒载体将外源基因导入植物细胞，通过瞬时表达来实现外源基因的快速高效表达。
病毒载体主要包括植物病毒（如烟草花叶病毒、植病毒等）和昆虫病毒（如斑驳花叶病毒、昆虫斑驳花叶病毒等）。
当病毒载体感染植物细胞后，外源基因可以在数小时内迅速表达，并在数天内积累到高水平。
植物瞬时表达系统可应用于多个领域。
在农业领域，瞬时表达可以用于快速生产植物抗性蛋白，如抗病毒蛋白、抗昆虫蛋白等，以提高作物的抗病虫害能力。
瞬时表达还可用于合成药物、生物农药和酶等生物制剂的生产。
在生物医学领域，瞬时表达可用于生产抗体和疫苗等生物制品，用于疾病的预防和治疗。
在生物工程领域，瞬时表达系统可以用于高通量筛选基因表达调控关键因子，以及用于分析外源基因在植物细胞中的功能和调控机制。
研究人员们在植物瞬时表达系统的研究中取得了许多进展。
病毒载体的可选择性得到了明显提高。
病毒载体可以根据不同的表达需求进行选择，使得瞬时表达系统更加灵活和高效。
研究人员利用基因编辑技术，在植物瞬时表达系统中实现了外源基因的定点插入和稳定遗传转化，从而在表达效率和基因稳定性方面取得了重大突破。
研究人员还发展了许多新的转染方法，如离体病毒感染、冷冻转染等，以进一步提高瞬时表达系统的表达效率和稳定性。
植物瞬时表达系统仍然存在一些挑战和亟待解决的问题。
病毒载体的选择性仍然有限，只能应用于某些特定的植物物种。
瞬时表达系统在大规模生产上还存在一定的局限性，需要进一步优化和提高生产效率。
目前关于瞬时表达系统的调控机制研究较少，需要进一步探索其在植物细胞中的具体调控机制，以提高表达效率和稳定性。
烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
Botanical Research 植物学研究, 2015, 4, 25-31Published Online March 2015 in Hans. /journal/br/10.12677/br.2015.42004Establishment and Optimization ofAgrobacterium-Mediated TransientGene Expression System in TabaccoLiwei Wen, Hongliang Zhu*Department of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, BeijingEmail: 210824@, *hlzhu@Received: Apr. 15th, 2015; accepted: May 1st, 2015; published: May 6th, 2015Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractTo establish and optimize a transient expression system in Nicotiana benthamiana, the method was developed with the β-glucuronidase (GUS) and Ripening Inhibitor (RIN) as marker genes. Us-ing the agrobacterium-mediated transformation method, GV3101 was used for the effects of dif-ferent bacteria concentration on the efficiency of protein transient expression in Nicotiana ben-thamiana. Observed by the results, a higher transient expression level of GUS & RIN gene could be obtained as OD600 value of A. tumefaciens for intiltration 1.0. The entire process only took 25 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this method is simple and rapid. It has a potential application in dissecting gene expression and function in Brassica napus.KeywordsTobacco, Leaf, Transient Expression System烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究文莉薇，朱鸿亮*中国农业大学，食品科学与营养工程系，北京Email: 210824@, *hlzhu@*通讯作者。
烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花[发明专利]
![烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/5a6261ff964bcf84b8d57b13.png)
专利名称：烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花
专利类型：发明专利
发明人：高玉龙,谢贺,肖炳光,李永平
申请号：CN201210462131.2
申请日：20121116
公开号：CN103045609A
公开日：
20130417
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，具体涉及烟草FT(Flowering locus T)基因NtFT1及其在诱导烟草早花中的应用，属于分子生物学中的基因领域。
本发明公开了源自烟草的控制植物开花时间的NtFT1基因全长编码序列及其编码的蛋白序列。
NtFT1基因是通过同源序列搜索，从中国烟草基因组测序计划数据中经Blastn比对及剪切位点分析得到的。
以此序列涉及出一对NtFT1基因特异引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了该基因。
本发明还构建了NtFT1基因的PVX病毒表达载体，构建的病毒表达载体经农杆菌渗滤侵染烤烟品种红花大金元、云烟87和K326，能诱导这些品种早花，证明该基因具有诱导烤烟早花的功能。
将NtFT1基因的PVX 病毒瞬时表达系统用于烟草育种，可缩短烟草生育期、加快育成烟草新品种的年限。
申请人：云南省烟草农业科学研究院
地址：653100 云南省玉溪市红塔区南祥路14号
国籍：CN
代理机构：昆明今威专利商标代理有限公司
代理人：赛晓刚
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植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统是一种用于合成和表达外源蛋白的方法，其具有高效、快速和经济的特点。
近年来，随着生物技术的发展，该领域取得了许多重要的研究进展。
本文将介绍植物瞬时表达系统的原理、优势和应用，并总结近年来的研究进展，展望其在农业生产、医药生物技术和工业生产等领域的应用前景。
一、植物瞬时表达系统的原理和优势植物瞬时表达系统是一种利用植物叶片或其他组织快速表达外源蛋白的技术。
其原理是通过植物病毒或农杆菌介导的转染，将外源基因导入植物细胞中，利用植物细胞的生物合成系统合成外源蛋白。
相比传统的植物转基因技术，植物瞬时表达系统具有以下优势：1. 高效快速：植物瞬时表达系统能够在较短的时间内表达大量外源蛋白，通常只需数天至数周的时间，远远快于传统的植物转基因技术。
2. 经济低成本：植物瞬时表达系统无需大量耗费时间和金钱的农业生产，通过简单的组织培养和转染技术即可实现外源蛋白的大规模表达，具有较低的生产成本。
3. 安全环保：相比于转基因作物，植物瞬时表达系统不会对环境和生态系统产生长期影响，安全性较高。
4. 可定制性：植物瞬时表达系统能够实现外源蛋白的快速定制和大规模生产，适用于不同的应用场景。
二、植物瞬时表达系统在农业生产中的应用1. 植物病毒疫苗：利用植物瞬时表达系统，可以快速合成和生产植物病毒疫苗，用于防治各种植物病毒病害，提高农作物产量和质量。
2. 抗虫、抗病基因的快速筛选：利用植物瞬时表达系统，可以快速表达和筛选出对虫害和病害具有抗性的基因，用于育种改良。
3. 其他农业生产相关的功能性蛋白的生产：例如抗氧化蛋白、生长调节蛋白等，可以提高作物抗逆性和增强产量。
除了农业生产领域，植物瞬时表达系统还在医药生物技术领域具有重要的应用价值：1. 疫苗和抗体的生产：利用植物瞬时表达系统，可以快速合成和生产各种疫苗和抗体，如乙肝疫苗、流感疫苗等，具有较低的生产成本和较高的生物安全性。
2. 药物的生产和筛选：通过植物瞬时表达系统，可以快速合成和筛选各种药物，如抗癌药物、免疫调节药物等，为医药研发提供新的途径。
烟草瞬时转化
创作编号：GB8878185555334563BT9125XW创作者：凤呜大王*本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。
*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1~4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。
*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.7 10nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
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烟草基因瞬时表达体系的建立与优化研究
文莉薇;朱鸿亮
【期刊名称】《植物学研究》
【年(卷),期】2015(004)002
【摘要】本研究以GUS基因和RIN基因作为报告基因,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101对烟草叶片注射侵染,探究了农杆菌侵染浓度对本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达效果的影响,建立并优化了烟草中的瞬时表达体系。
结果表明,β-葡萄糖苷酶(GUS β-glucuronidase)基因与RIN基因在OD600 = 1.0的侵染浓度时表达效果最佳。
农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达方法简单高效,结果准确可靠,从种子播种到收获蛋白只需25天左右。
该体系的建立与优化为基因表达和蛋白功能性研究等方面提供了一定支持。
【总页数】7页(P25-31)
【作者】文莉薇;朱鸿亮
【作者单位】[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京;;[1]中国农业大学,食品科学与营养工程系,北京
【正文语种】中文
【中图分类】S5
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