农杆菌介导的瞬时表达系统
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（PES）是一种用于在植物中快速、高效地表达外源蛋白的技术。
它是基因工程领域中非常重要的工具，被广泛应用于植物基因功能研究、植物生物工程以及植物疫苗和药物生产等方面。
在过去的几十年里，关于植物瞬时表达系统的研究取得了许多重要的进展，这些进展在优化表达系统、提高表达效率、缩短表达时间和拓展应用领域等方面具有重要意义。
本文将介绍植物瞬时表达系统的基本原理、研究进展以及未来的发展方向。
一、植物瞬时表达系统的原理植物瞬时表达系统是利用几种不同类型的病毒或细菌，如农杆菌（Agrobacterium），烟草花叶病毒（TMV）和土壤细菌等，将外源基因导入植物细胞中，并在短时间内表达出目的蛋白。
基本的操作流程包括：将外源基因插入载体中，然后将载体转化到病毒或细菌中，最后通过侵染或注射等方式将这些病毒或细菌导入植物细胞内，从而实现外源基因的表达。
相比于转基因植物技术，植物瞬时表达系统具有表达时间短、转化效率高、不易产生突变和遗传稳定等优点。
它在植物基因功能研究和植物疫苗、药物等生产方面有着广阔的应用前景。
二、研究进展1. 优化表达系统随着对病毒和细菌基因工程技术的深入研究，人们不断优化植物瞬时表达系统，以提高表达效率和稳定性。
研究人员对载体和表达引物进行了优化，选择了更加适合植物转化的载体和引物，使得外源基因在植物中的表达更加高效和稳定。
病毒和细菌基因工程技术的进步也为植物瞬时表达系统的优化提供了更多可能性，不断地推动着这一技术的发展。
2. 提高表达效率为了提高表达效率，研究人员采用了各种策略，如优化表达条件、改进载体构建和转化方法、筛选适合的宿主植物等。
利用基因组学、蛋白组学等高通量技术，对植物瞬时表达系统进行了深入研究，揭示了植物基因表达调控的机制，为提高表达效率提供了理论基础。
3. 缩短表达时间在研究过程中，人们发现植物瞬时表达系统与传统的转基因技术相比，具有表达时间短的优势。
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【摘要】A method for transient expression based on Agrobacterium infiltration into cotyledons of Brassica napus L. cv Ningyou 16 was developed with the Green Florescent Protein (GFP) as a marker gene. GFP expression vector pB2GW7. 0-gfp was constructed and transferred into agrobacterium. The addition of P19 protein improved the transient expression level of GFP in cotyledon. Reverse transcription assay showed that GFP was expressed after 4-8 days of agrobacterium infiltration. Confocal microscopical analysis revealed that epidermal cells and guard cells could be transformed by agrobacterium-based transformation method. The entire process only took 20 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this new method is simple and rapid. It has a potential application in dissection genes expression and function in Brassica napus.%实验以甘蓝型油菜宁油16为材料,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,建立了农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统.我们构建了GFP表达载体pB2GW7.0-gfp,并成功转化农杆菌.实验中通过添加P19来提高GFP在油菜子叶中的瞬时表达量.并提取了注射有P19和pB2GW7.0-gfp农杆菌混合液的油菜子叶RNA,经RT-PCR鉴定,发现在4 ～8 d GFP均能表达.激光共聚焦显微镜分析表明农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统能够转化油菜子叶的表皮细胞和保卫细胞.甘蓝型油菜子叶瞬时表达方法简便、快速、可靠,从种子播种到获得荧光蛋白表达,全过程只需要20d.表明在研究油菜基因的表达和功能方面有潜在的应用前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】4页(P93-96)【关键词】甘蓝型油菜;子叶;农杆菌;瞬时表达【作者】谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【作者单位】江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;中国农业科学院油料作物研究所,武汉430062;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013【正文语种】中文【中图分类】Q786油菜在世界各地广泛种植，在油料作物中其产量仅次于大豆与棕榈，位居第三。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（plant transient expression system）是指利用植物细胞暂时转化技术，将外源基因转为至植物体内的高效表达系统。
与其他表达系统（如大肠杆菌、哺乳动物细胞等）相比，植物瞬时表达系统具有以下优势：快速性、低成本、无病原性、可大规模生产等。
近年来，植物瞬时表达系统已经成为植物基因工程领域的研究热点之一。
下面将从基本原理、转化技术、应用以及存在的问题等方面进行综述。
一、基本原理植物瞬时表达系统利用植物组织或细胞中的转化技术（如农杆菌介导转化、雨生病毒等），将外源基因导入植物细胞内。
然后，利用植物体内的植物病毒启动子将外源基因与病毒RNA一同表达，从而实现外源基因的高效表达。
该系统具有以下特点：1）能够同时表达多个外源基因；2）表达水平高且可调控；3）表达时间短暂，MEMS（minutes to hours）级别；4）可以用于植物体内和植物细胞水平的瞬时表达。
二、转化技术1.农杆菌介导转化农杆菌介导转化是当前应用最广泛的一种植物瞬时表达系统。
其基本原理是将外源基因插入至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）植物病原性质粒中，将农杆菌与目标植物细胞接种在一起，通过寄生菌的病理学作用将外源基因成功转化至目标植物细胞中。
该技术具有操作简单、转化效率高等优点。
但是由于农杆菌介导转化仅对部分植物有效，而且对于一些重要物种仍然存在难以克服的技术难题。
2.雨生病毒技术雨生病毒技术是利用雨生病毒有效传播的能力，将外源基因转入植物细胞，然后利用植物体内的病毒启动子进行表达。
由于雨生病毒非常小，可以在分子水平广泛传播，故该技术具有操作简单、适用范围广等优点。
然而，该技术的载体转化量有限，不适用于大规模生产。
三、应用1.基因功能定位植物瞬时表达系统在基因功能定位方面开拓了新的思路。
通过转化不同的融合蛋白并观察它们在植物细胞内的定位，可以快速确认目标蛋白的亚细胞定位，从而为基因功能的深入研究提供良好的方向。
月季花瓣中农杆菌介导的基因瞬时表达体系的优化及其在rnai中的应用
月季花瓣中农杆菌介导的基因瞬时表达体系的优化及
其在rnai中的应用
在植物中通过农杆菌介导的基因瞬时表达和基于RNAi的基因沉默可便捷高效地研究基因功能.本研究采用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)注射侵染法,利用GUS作为报告基因,探讨了月季(Rosahybrida)品种、农杆菌菌株、开花级别、花瓣位置、农杆菌侵染浓度和侵染液成分等因素对月季花瓣中基因瞬时表达效果的影响.结果表明,月季品种蜜糖3级切花的中层花瓣中瞬时表达效果最佳;农杆菌菌株GV3101介导的瞬时表达效果最好,侵染浓度以OD600=0.9为宜,添加10mmol/LMgCl2及10mmol/LMES的侵染液效果优于重蒸水。
同时,利用上述优化瞬时表达体系进行RNAi沉默,成功抑制了外源报告基因GUS和内源基因RhSAG的表达。
相比对照,RhSAG沉默花瓣的萎蔫速度较慢,说明衰老进程得到延缓.该体系的优化为月季花瓣中基因功能的鉴定提供了有效工具。
植物瞬时表达技术的主要方法与应用进展
［Abstract］ Transient expression is a technology to highly express the target gene in a short time. Compared with stable expression, transient expression is speedy. On the other hand, exogenous gene doesn't integrate into the host chromosome, so it won't be inherited. We briefly introduced the main methods of plant transient expression technology, including their principles, technique procedures, influencing factors, and applications. This technology could be widely employed in the synthesis of many plant derived biologicals, clone and analysis of the transcrip⁃ tion components and transcription factors, gene silence, observation of protein subcellular localization and interac⁃ tion, identification of the inhibitor's function, study of alternative splicing, as well as in the plant improvement and breeding, etc. ［Key words］ transient expression; gene gun; Agrobacterium tumefaciens; polyethylene glycol; plant virus vector
农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用
农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用作者：宋建刘仲齐来源：《天津农业科学》2008年第01期摘要：主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用。
关键词：农杆菌；植物；基因瞬时表达中图分类号：Q789文献标识码：A文章编号：1006—6500(2008)01—0020—03把外源基因导入受体植物内，是研究基因功能和获得遗传修饰有机体的主要手段。
农杆菌介导法是目前最常用的遗传转化方法，当农杆菌感染植物受伤组织后，质粒上的目标基因可以进入植物细胞内并整合到植物染色体中，这种转化细胞经过诱导分化，再生成为转基因植株。
通常大多数植物的遗传转化和再生效率低下，费时且费用昂贵。
即使对于转化程序大大简化的植物，例如拟南芥，仍然需要花费数月的时间来产生适合分析的转基因植株。
农杆菌介导的瞬时表达提供了一种快速分析基因型功能的方法，该方法是Rossi等在1993年创建的。
他们将带有重组质粒的农杆菌，经诱导后通过抽真空渗透入植物叶片进而渗透入植物细胞，通过目的基因瞬时表达来检测植物中农杆菌介导的T-DNA转移的效率。
随后人们又采用针管注射活体植株叶片，来进行农杆菌介导的基因瞬时表达检测。
近几年该项技术不断完善、发展，已被广泛用于外源基因表达分析、无毒基因与抗性基因的相互作用、基因沉默、启动子分析等许多植物分子生物学领域。
1主要原理农杆菌介导的瞬时表达是将目的基因插入共整合载体或双元载体，转化根癌农杆菌，后者经酚类化合物诱导处理后，通过真空渗透或针管注射入植物叶片组织中，农杆菌在叶片内与植物细胞紧密接触。
诱导处理在转录水平激活Vir区基因，真空渗透或注射使得农杆菌与植株叶片细胞接触，从而实现了T-DNA转移进入植物细胞核。
大部分T-DNA并未整合入植物基因组而是暂时存在于核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达T-DNA基因，通常在数小时后即可检测到外源基因的表达，并在1～2d内达到最高值。
农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及应用
ｎｉｑｕｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｅｘ— ｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅｓ，ａｎａｌｙｚｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｓｉｌｅｎｃｅ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ．Ａｎｄ ｉｔ ａｌｓｏ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｅｄ ｃｒｏｐｓ，ｅｔｃ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
１贵州大学生命科学院，贵阳，５５００２５；２贵州省农业生物技术重点实验室，贵阳，５５０００６；３贵州省植物保护研究所，贵阳，５５０００６ ＋通讯作者，ｌｉｕｚｕｏｙｉ＠ｙａｂｏｏ．ｔｏｍ．ｃｎ
摘 要农杆菌渗入法是在植物中瞬时表达外源基因的一种方法，该方法通过在植物叶片上注射农杆菌，使 目的基因转入植物细胞中进行快速表达。本文综述了农杆菌渗入法的原理、技术流程、影响因素及其应用，其 应用主要涉及外源基因的表达、检测转基因的表达、启动子分析、转录后基因沉默、抑制子功能鉴定、细胞定位 以及基凶相可＝作用等方面。随着技术的进一步完善，我们相信该技术将成为转基因育种领域的重要的手段。 关键词 农杆菌渗入法，转基因，瞬时表达
大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用
大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用一、引言大豆（Glycine max）是我国的主要农作物之一，其种子含有丰富的优质蛋白质和油脂，被广泛用于食品加工、饲料生产和生物能源开发等领域。
然而，提高大豆的产量和抗逆性一直是大豆育种领域面临的挑战。
为了解决这一问题，科研人员不断努力，建立了大豆瞬时转化体系和遗传转化体系，并将其应用于大豆育种中，取得了显著的成果。
二、大豆瞬时转化体系的建立与应用1. 大豆瞬时转化体系的概念及原理大豆瞬时转化体系是指利用农杆菌介导法将外源基因导入大豆离体部分，经瞬时表达后再转移到植株体内的一种转化技术。
该技术的核心原理是通过利用农杆菌的T-DNA片段将目的基因导入大豆受体细胞，利用激素和植物生长物质的作用，实现外源基因在大豆植株体内的转化和表达。
大豆瞬时转化体系的建立为大豆遗传改良提供了重要的技术手段。
2. 大豆瞬时转化体系的应用进展利用大豆瞬时转化体系，科研人员已经成功地转化了多种外源基因，并将其导入大豆植株体内。
通过该技术，不仅可以实现外源基因在大豆植株体内的高效表达，还可以实现特定基因的靶向编辑和调控。
利用大豆瞬时转化体系成功导入了抗病基因、抗逆基因和营养改良基因等，为大豆的抗病、抗旱、抗寒和产量性状的改良提供了重要的技术支持。
三、大豆遗传转化体系的建立与应用1. 大豆遗传转化体系的概念及原理大豆遗传转化体系是指利用基因编辑技术，通过CRISPR/Cas9系统等工具对大豆基因组进行精准编辑和改造的一种转化技术。
该技术的核心原理是利用CRISPR/Cas9系统的靶向特异性，将Cas9蛋白和RNA 导向的DNA裂解酶导入大豆细胞内，通过靶向编辑特定基因，实现对大豆遗传特性的调控和改良。
2. 大豆遗传转化体系的应用进展近年来，大豆遗传转化体系的应用进展迅速，科研人员已经成功地利用CRISPR/Cas9系统对大豆的多种性状进行精准编辑和改良。
通过该技术，不仅可以实现对大豆产量、品质和抗逆性状的调控，还可以实现对大豆次生代谢途径和生长发育过程的精准编辑。
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农杆菌介导的瞬时表达系统
一．溶液配制
乙酰丁香酮AS 0.1M，取0.101gAS溶于5mLDMSO中，在工作台上用灭过菌的0.45μM滤膜过滤,分装入无菌小管，-20℃冰冻保存；
MES 1M 调pH=5.6，过滤除菌；
MgCl2 1M 过滤后灭菌；
Kan 终浓度100mg/ml，过滤除菌。
(AS ，MES均购自泰安齐旺试剂公司)
YEB过夜培养液(30ml)
MES AS Kan 10mM
20μM
50μg/ mL
300μl
6μl
15μl
悬浮培养液(50ml)
MES 10mM 500μl AS 200μM 100μl MgCl2 10mM 500μl YEB培养基(pH 7.2)
酵母膏
牛肉膏
蛋白胨
蔗糖
MgSO4·7H2O 1g/L
5g/L
5g/L
5g/L 493mg/L
二．操作步骤
1. 挑起单个农杆菌菌落，接种3mL YEB培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜，储存时间比较长的菌液可多活化两次；
2. 接种2mL过夜培养的50mL的YEB液体培养基（含抗生素，10mM MES和20μM乙酰丁香酮），28℃摇床培养2-4h；
3. 将上述过夜培养菌液在4℃，8000g下离心6min，收集菌体；
4. 用渗透培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞。
调节浓度OD600至0.5-1.0（一般需要100-150mL渗透培养液），置室温培养至少3小时，无需振荡；
5. 对需要渗透处理的烟草植株无一定大小要求，一般4-5叶期，已经生长一个月左右的本生烟比较合适。
一般渗透处理下部2-3个比较大的叶片。
用针头在需要渗透处理的叶片背面非常细微地扎一细小的浅微孔，然后用3mL的无针头的注射器吸取2-3mL悬浮有农杆菌的渗透培养液，从针孔处将培养液轻微的注入叶片内。
注意用一手指从叶片下面拖住叶片，将注射器平平地堵住针孔，不让液体从叶片边缘挤压出来。
注射区域接近叶片边缘即可或根据自己的实验目的决定；
6. 将处理过的烟草放回温室，照常管理。
一般沉默发生在2-5天内；
7. 在暗室里，利用长波紫外灯（MODEL SB-100P/F,365nm）观察渗透处理过的叶片，并拍照记录叶片侵染区绿色荧光表达的变化过程。