农杆菌介导转化和再生的杨树
农杆菌介导法
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁 香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食 子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基 苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。 双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子， 而使T- DNA可以成功的转入； 而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区 的基因，达到转基因的目的。
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP 1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。 1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
VirD
4.5
4
16,47,21,75
C/M?
T-DNA border endonuclease (VirD1 and VirD2); pilot protein? nuclear localization?(VirD2)
VirC
2.0
2
26,23
C?
processing of T-DNA(VirC1)
最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接 受环境中的信号分子。 在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状 态，进而激活vir区其他基因表达。 其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为 松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使 单链T-DNA得以释放。 VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的 核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。 T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终 整合进入植物核基因组。 T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表 达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化，使外源基因被导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用，为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤：1. 农杆菌感染植物细胞。
首先，将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中，然后将农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。
2. 植物细胞内基因导入。
农杆菌感染植物细胞后，Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。
这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因，通过农杆菌的介导，成功导入到植物细胞内。
3. 外源基因整合到植物基因组。
一旦外源基因进入植物细胞内，它们会与植物细胞的染色体发生重组，将外源基因整合到植物基因组中。
这样，外源基因就成为植物细胞的一部分，可以被遗传到后代植物中。
4. 外源基因表达。
一旦外源基因整合到植物基因组中，它们就会开始在植物细胞内进行表达。
外源基因的表达可以使植物获得新的性状，比如抗病虫害、耐逆境等，从而实现对植物性状的改良。
农杆菌转化法的原理简单清晰，通过这种方法可以实现对植物基因的改造，为农业生产提供了重要的技术手段。
在实际应用中，农杆菌转化法已经成功应用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆等，为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理清晰，操作简单，成功率高，因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和完善，相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。
南京林业大学重点学科简介——林木改良与种质创新
南京林业大学重点学科简介——林木改良与种质创新江苏省重点学科——林木改良与种质创新◆学科简介本学科利用高新生物技术和系统生态理论，充分发挥苏北的光热水土资源，培育了以杨树新品种为基础、杨木加工利用为龙头的江苏杨树产业。
使昔日风起飞沙满天、碱花片片的苏北大地致富脱贫，已发展成为支柱产业。
如今，苏北大地，一片片杨树林郁郁葱葱，杨树防护林纵横交错，绵延数百公里，道路绿树成荫，一望无际。
苏北农村生气勃勃，气象万千。
这一切都是由我学科经过30多年的艰苦奋斗，将选育出一大批杨树优良品种，在苏北农村，大力推广的结果。
目前全省杨树总面积175026公顷，总蓄积量近4800万m3，每年上市的商品材近400万m3，直逼华东木材大省福建。
目前全省大中型木材加工企业30多家，加上乡镇企业数以千计，均以杨树为主要原料生产胶合板、细木工板、多层板、贴面板、刨花板、中密度纤维板等，年销售总额达92.28亿元，产品销售日本、韩国、新加坡、意大利、美国和中东地区。
当前江苏省的胶合板产量已跃居全国第一，这在江苏经济发展史上是前所未有的。
江苏省率先在全国形成了个颇具规模的新兴产业——杨树产业，并成为苏北各县的富民强县的重大举措，促进了农村经济的发展，增加了农民的收入。
除此以外，本学科在宜、溧山区和宁镇丘陵地区大面积推广杉木、马尾松、枫香和马褂木等良种，对繁荣山区经济也发挥了重要作用。
◆目前主要研究内容①利用细胞工程和基因工程技术与常规育种相结合，选育高产、优质、抗病虫害的杨树新品种；②本学科与营林、木材工业、林产化工等学科交叉渗透，用高新技术改造传统产业，开发新板种，生产高附加值的产品，提高经济效益；③对全省32个杨树基地县实行全方位的技术服务。
在淮阴、宿迁、徐州、盐城等市建立杨树良种繁育基地，形成市—县—乡（镇）良种推广体系；并在各市营造大面积的示范试验林，进行定向培育。
指导广大农民科学培育杨树，达到高产、优质和高效的目的，使农民迈上致富路，实现小康。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素1.农杆菌感染：农杆菌通过其特有的类纤毛附着剂蛋白(T4SS)结构与植物细胞进行初步接触和附着。
2. 感染信号传递：在与植物细胞接触后，农杆菌释放并传递一系列感染信号，包括有效异常淋巴细胞(QvrAB)的诱导、拟南芥(Ca2+)离子内涵物的释放、脑心肌炎物质(AHL)的转运和细胞壁酶的活化等。
3.感染信号诱导细胞凋亡：感染信号的诱导会引起植物细胞凋亡，从而产生切伤的部位或孔洞，在这些切伤或孔洞中形成转化DNA理论允许进入的环境。
4.DNA传递：农杆菌通过T4SS释放线性转化DNA，并借助激发剂打开DNA链，并且该辅助剂经常与T-DNA共同转移到植物细胞总群落中。
5. 植物细胞再生：经过切伤或孔洞进入植物细胞的转化DNA在细胞质中被转录，转录本通过RNA splicing进一步处理并通过核孔复合物进入细胞核。
在细胞核中，转录本通过与受体蛋白结合而在柏氏体中形成mRNA。
mRNA会进一步被转录为蛋白质，这些蛋白质会促进植物细胞再生。
1.植物物种：不同植物物种对于农杆菌的感染和转化效率具有差异。
有些植物对农杆菌的感染和转化具有天然的耐受性或敏感性。
2.植物组织类型：不同植物的不同组织对于农杆菌的感染和转化效率也有所差异。
例如，幼嫩的愈伤组织对于农杆菌的感染和转化效率通常较高。
3.农杆菌菌株：不同菌株具有不同的亲和力和感染能力。
有些农杆菌菌株能够高效地感染和转化植物细胞，而有些菌株效率较低。
4.结构改造：农杆菌通过改造表面酶结构以增加其细胞壁附着能力，从而提高农杆菌感染和转化效率。
5.切伤或孔洞大小：适当的切伤或孔洞大小能够促进农杆菌介导植物转化的效率。
切伤或孔洞过小会限制转化DNA进入细胞，而切伤或孔洞过大则会增加细菌感染的难度。
总之，农杆菌介导植物转化是一种复杂的生物学过程，其效率受到多个因素的影响。
进一步研究和优化这些因素可以提高农杆菌介导植物转化的效率，为植物遗传工程提供更多的可能性。
农杆菌介导转化和再生的杨树讲解
农杆菌介导法转基因杨树摘要：杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。
叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。
致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。
没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。
然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。
NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。
这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。
关键词：白杨；转化；农杆菌前言基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。
森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。
方法，例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。
根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。
可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。
一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用
一种发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法和其应用一种常用的发根农杆菌介导的转基因杨树的构建方法是利用农杆菌介导的遗传转化技术。
该方法主要包括以下步骤：1. 构建转基因载体：首先，选择合适的载体，如农杆菌受体质粒(pCAMBIA系列)。
然后，将目标基因的编码序列插入到载体的适当位点上，并添加合适的启动子、终止子等调控元件。
2. 农杆菌培养：接下来，将构建好的转基因载体转化到农杆菌中，将该菌株在适宜的培养基中培养至菌液浓度达到一定程度。
3. 植物杨树的样本处理：从要转化的杨树中取一些新生芽或叶片作为样本，进行消毒处理，以去除杂菌。
4. 农杆菌介导的遗传转化：将农杆菌菌液和杨树样本共同处理，可以通过浸泡法、伤口注射法或利用农杆菌耐冻性侵染方法等手段。
5. 培养和筛选转基因杨树：将处理后的样本在适宜的培养基上进行培养，待转基因杨树生长出来后，利用适当的筛选方法去除未转化的杨树细胞。
6. 鉴定转基因杨树：对转基因杨树进行PCR扩增、Southern杂交等方法进行鉴定，确定其是否成功转化。
7. 进一步培养和繁殖：将鉴定通过的转基因杨树进行进一步培养和繁殖，以得到足够数量的转基因杨树。
转基因杨树的应用主要包括以下几个方面：1. 抗逆性提高：通过引入耐盐、耐干旱、耐寒等抗逆基因，增强杨树对环境逆境的适应能力，提高生存率和产量。
2. 木质纤维改良：通过引入纤维素合成相关基因，增强杨树木质纤维的产量和质量，提高杨树的木材利用价值。
3. 生物能源生产：通过引入生物质降解酶的基因，增强杨树木质纤维的降解能力，提高生物能源的产量。
4. 农药抗性改良：通过引入抗虫、抗病等相关基因，提高杨树对害虫和病原体的抵抗能力，减少农药的使用。
5. 环境修复：通过引入重金属吸收、分解等相关基因，增强杨树对重金属的吸附和分解能力，用于环境修复和污染治理。
总之，农杆菌介导的转基因杨树的构建方法可以为杨树的遗传改良提供途径，具有重要的应用价值。
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。
其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。
本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。
一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。
它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。
因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。
农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。
其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。
二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。
例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。
在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。
其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。
此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。
为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。
一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。
根癌农杆菌介导杨树遗传转化的影响因素
ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ ｏ ｆ Ｐｏ ｐ ｕ ｌ ｕ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｅ ｘ ａ ｍｉ ｎ ｅ ｄ ，ｉ ｎ ｃ ｌ ｕ ｄ ｉ ｎ ｇ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｌ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ（ Ｐｏ ｐｕ ｌ ｕ ｓ ｇ ｅ ｎ ｏ ｔ ｙ ｐ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｅ ｘ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｓ ｔ ｙ ｐ ｅ ｓ ） ，ａ ｎ ｄ
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Ｉ ｎ ｆ ｌ ｕ ｅ ｎｃ ｅ Ｆａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ｏ ｎ Ａ ｇｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕｒ ｎ ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｔｒ ａ ｎｓ ｆ ｏｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｅｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ ｏ ｆ Ｐｏ ｐｕｌ ｕ ｓ
部 因素 ， 培 养基 、 培 养条件 、 ｖ ｉ ｒ 基 因诱 导物 、 抗 生素等 外部 因素 。总 结 了在 实际操 作 中应该 注意 的 问题 ， 为更好 地利 用根 癌农杆 菌介 导 法开展 杨树 遗传 转化 ， 提 高转化 效率提 供借 鉴和 参考 。
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农杆菌介导法转基因杨树摘要：杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。
叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。
致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。
没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。
然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。
NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。
这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。
关键词：白杨；转化；农杆菌前言基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。
森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。
方法，例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。
根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。
可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。
这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体，悬浮细胞，外植体组织的共培养，可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。
因此，我们着手开发一个混合型杨树无性系，银白杨x grandidentata的（NC - 5339 ）作为载体的农杆菌转化体系。
有许多特征能使杨树NC-5339得到理想的转化研究首先，杨树是一个重要的全球森林树种。
这是一个快速增长的落叶阔叶树，栽培主要用于纸浆生产。
对于短期循环杨树种植园的建立和管理的一个主要限制因素是缺乏一种广谱除草剂，从而有效地控制杂草(Akinymiju etal. 1982; Hansen and Netzer 1985; Nelson and Haissig 1986)。
因此，生产的杨树品种抗此类除草剂具有经济吸引力。
介绍草甘膦耐受性的嵌合基因(Comai et al. 1985) 杨树杂交提供了一个独特的机会对于杂草控制。
野生型菌株，如杨树虫瘿上已分离出27株（基恩等人1970年生）和应变AT181（西亚基等人，1978）。
最近，杨树再次作为宿主的根癌农杆菌展示瘿组织中存在的T-DNA序列（Parsons等人，1986），但是，迄今为止的根癌农杆菌还没有被成功地用作载体将外到杨属植物重要农艺性状的基因。
第三，杨树是一个属森林树木的成员，其经受得起体外操纵。
杨树的苗培养可以保持在体外和用于无性繁殖，从而提供了一种无菌的细菌的共培养实验中的外植体材料的来源。
此外，大量的繁殖体可以迅速获得用于实验或商业目的（1978视Christie;麦科恩1985）。
在本文中，我们描述了胡杨NC-5339植物外源基因系统的转移和表达。
农杆菌的遗传转化使用二元的致瘤菌株突变aroA基因，编码5 - 烯醇丙酮酰莽草酸 3 - 磷酸合酶（EPSP）较不敏感的除草剂草甘膦，背引入到杨树NC-5339植株。
aroA基因的稳定整合和表达由Southern和Western印记分析证实。
这是首次报道的同时改造再生的森林树种。
材料与方法植物培养及再生。
苗培养建立在一个杨树杂交克隆，银白杨x大齿杨（NC-5339），麦科恩（1985）所描述的。
Murashige和Skoog培养基中蔗糖（30克/升），和植物琼脂（0.6％）（血清）中的最小的有机物，用于初始培养和随后的次生培养。
培养基用氢氧化钾溶液将pH值调节至5.6，高压灭菌培养基20分钟在121°C. 红色苯胺染料（芝加哥），GA7培养容器，含有50毫升培养基，用于维持苗的培养。
这种培养基也被用于白杨生根培养。
苗的培养是除去叶片和顶芽，并把切下的茎水平铺到新的培养基上来维持嫩腋芽每四个星期出现。
所有培养物生长在受控环境室在25°C_+2°C，采用冷白荧光灯50微摩每米每2秒(50g Em 2S)在16 h光照天为一个周期。
从叶片外植体芽再生培养基（如上所述）维护培养通过添加BA（1.0毫克/升）和玉米素（ZEA）（1.0毫克/升）。
高压灭菌后，冷却至50℃，羧苄青霉素（500毫克/升）（抑菌物质）和卡那霉素（60毫克/升），（选择性抗生素），除菌过滤器，根据需要向培养基中加入。
然后将该培养液分配到100×15毫米的培养皿中（35-40毫升，每盘）。
菌株。
根癌农杆菌菌株LBA4404中是一种非致癌衍生物ACH5的T-DNA已被删除（赫克玛等人，1983 ）。
该菌株携带一个完整的VIR区域，并可以调解引入任何T - DNA存在于植物的细菌进入。
Ç 58是一个致癌的，胭脂碱生产的应变农杆菌的遗传转化（汉密尔顿和1971年秋季）。
双载体引入pPMG85/587株LBA4404和C58 。
此质粒携带的变形的T-DNA中，有三个嵌合基因（图1）。
这些基因编码新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ'）的抗性对抗生素卡那霉素（Bevan 等人，1983; Fraley等人，1983 ; Herrera的埃斯特雷亚等，1983），两个并拼接到羧乙基精氨酸合成酶启动子（ocs- NPT Ⅱ'）（Barker等人，1983）或甘露碱合成酶启动子（mas-NPT Ⅱ'）（Barker等人，1983）。
第三个基因赋予耐受除草剂草甘膦（Comai等，1983），并已接合的甘露碱合成酶启动子（主重组质粒中的aroA ）。
农杆菌维持在AB固体基本培养基（Watson等，1975），补充的情况下，卡那霉素100毫克/ 1株含有pPMG85/587 。
文化被重新划线每十五天。
共培养从新鲜的划线板的单个菌落接种到5毫升MG / L液体培养基（奇尔顿等，1974 ），在25×150mm的培养管中，培养过夜。
当时过夜培养稀释至合适的浓度（C 58 / 85分之587和C58 ; 2×10秒菌落形成单位/毫升;应变LBA4404/587/85 ：5-10×L0小号个菌落形成单位/毫升）的培养物在550nm处的吸光度的菌株测量细菌浓度。
转化的杨树NC-5339，通过以下方式获得在烟草悬浮培养细胞的存在下（Horschet人，1985）的根癌农杆菌共培养的叶片段。
烟草进纸器板，制备前2天，通过移液陪替氏培养皿（100×25毫米），含有50毫升的Murashige最小的有机物介质（KC生物），补充了2,4-D（0.1到0.5毫升的烟草悬浮培养中使用毫克/升）激动素（1.0毫克/升）的盐酸硫胺素（0.9毫克/升），酸式磷酸钾（200毫克/升），Difco细菌琼脂（0.8％）。
第2天，无菌滤纸的培养皿（Whatman 公司3毫米）被放置在顶部的烟草细胞。
预洗涤滤纸圆片在蒸馏水中，高压灭菌在烟草悬浮介质中（如上所述），但无琼脂的。
烟草细胞悬浮液用于馈线板块维持每周转移10毫升的细胞——凝聚剂锡安到100毫升新鲜液体培养基。
使用的介质为维护烟草细胞悬浮液(描述上图)是相同的培养基，为了在馈线板上划线防治琼脂的遗漏。
烟草器板制备后，杨树叶子获得从无菌苗培养，切成段（~2cm 2），培养基中培养24小时，在光线不足的条件下，在25°C（10家创业板2 SL）。
叶片段，然后放置到1-5毫升MG / L液体培养基中培养：农杆菌菌株C58/587/85，C58或应变LBA4404/587/85稀释到适当的浓度。
30分钟后，叶段涂抹删除多余的悬浮液用到划线培养48-96小时的细菌。
叶片随后被转移到再生培养基中含有羧苄青霉素（500毫克/升）和卡那霉素（60碎布/ 1或0的破布/升）中，如上所述。
芽被切除时，他们约1-2厘米长，从叶腋传播芽如上所述。
杨树nc-5339叶的外植体芽再生率被确定通过得到许多外植体再生芽和通过计算来自其中每个外植体芽发育的数量。
这个收集的数据来自两个独立的实验其中每个处理至少有三个平板（每个平板就个外植体）。
平均的外植体再生芽和每个外植体再生芽的平均数来计算。
平均每个板的百分比值是由一个反正弦进行的。
对于每个平均数，其标准偏差和标准误差都要计算（1982年Sincich）。
进行一个一个尾随关于总体平均数的t检验确定控制（不是共培养）和共同栽培的外植体的再生率是否有著差异（1982年Sincic）。
分子量分析。
新霉素磷酸转移酶II（NPTⅡ'）赋予抗卡纳霉素可以直接选择转基因植物组织。
活性酶II'叶片和嫩枝转化和对照植物的测定采用的Reiss等人的方法。
1981年，通过加入最后清洗。
蛋白酶K，p - 81离子交换纸冲洗三次解决(1.0 Ixg /毫升)在90°C减少非特异性结合的32 po4磷酸化蛋白。
要确定是否野生型的T-DNA在拉力C58表示，胭脂碱进行检测叶片样本和B型芽。
胭脂氨酸测定进行了描述和Schilperoort (1978)。
Western印迹分析。
Western印迹分析细菌的EPSP合酶的由aroA基因所编码Comai等描述的。
(1985),除了最初的准备组织提取物。
叶组织（0.5克），用0.2克在液氮中研磨聚乙烯吡咯烷酮polyclar的AT和悬浮在2.0毫升的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.6，含有10mM150毫米氯化钠，EDTA，0.05％NONIDET P-40，25毫克/毫升血清白蛋白，10mM的二硫苏糖醇，10mM的硫脲，10〜的tM亮抑酶肽。
DNA分离和southern的分析。
从1g叶片或芽组织通过以下方式DNA提取。
组织在液氮中冷冻，用研钵粉碎杵和一个Brinkmann Polytron匀浆具有7个10秒的脉冲在10毫升的核隔离缓冲液（的10mM三异丙基乙磺酰，pH值9.5 ，4 mM的亚精胺，1 mM的精胺，10mM的EDTA ，80mM的KCl，0.5 M蔗糖，10mM的β-巯基乙醇，0.5％的Triton X - 100 ）在0°C过滤。