农杆菌转化法基本操作与理论
1农杆菌转化法的原理是
1农杆菌转化法的原理是农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转化法是一种重要的基因转化技术，广泛应用于植物基因工程研究和农业生产中。
其原理基于农杆菌与植物细胞间的相互作用，利用农杆菌外源DNA（T-DNA）的引导作用将目标基因嵌入到植物细胞的染色体中。
农杆菌转化法的主要步骤包括农杆菌培养、感染、共培养和筛选。
具体来说，其原理可分为农杆菌感染、T-DNA引导、T-DNA拼接和植物细胞接受等几个阶段。
首先，农杆菌感染是农杆菌与植物细胞发生接触的过程。
农杆菌通过外源的感染素（vir蛋白）介导，诱导植物细胞在感染部位生长出肿瘤组织，为转化提供了良好的环境。
感染素能够识别并结合到植物细胞的切伤部位，进而形成感染结构。
接着，T-DNA引导是农杆菌T-DNA（转座子DNA）与植物细胞染色体DNA 之间的互作过程。
农杆菌T-DNA原先位于质粒中，通过T-DNA上的边缘重复序列（LB和RB）以及其中的转移基因（transgenes）引导将T-DNA插入到植物细胞染色体中。
T-DNA在感染素作用下从质粒中剪切出来，再与植物细胞的染色体DNA发生重组，将T-DNA嵌入到染色体的随机位置。
随后，T-DNA拼接是指T-DNA与植物细胞染色体DNA发生重组并嵌入到染色体的过程。
T-DNA的LB和RB序列能够诱导农杆菌酶系统切割起始位点（nick sites），将T-DNA与染色体DNA连接起来。
然后，T-DNA和染色体DNA之间发生DNA重组，形成补充植物基因组的新构建（chimeric construct）。
这一过程具有较高的随机性，T-DNA可能嵌入到不同的染色体位点，并且还有可能发生多个T-DNA拼接。
最后，植物细胞接受是指植物细胞在T-DNA拼接完成后仍能够正常生长和分化。
当T-DNA成功嵌入植物细胞染色体后，植物细胞会通过自身的修复机制进行DNA修复，恢复正常的遗传信息。
如果T-DNA中存在目标基因，那么该基因就被整合到了植物细胞的染色体中，并能够在细胞分裂和再生的过程中被遗传和表达。
农杆菌转化法详细过程
农杆菌转化法详细过程
一、质粒的构建
1、结合胞外表达载体DNA片段：根据需要，挑选合适的质粒载体，通常是常用的pUC18或pUC19，然后从受体DNA片段中提取事先选择好的促进脱附酶及其他酶结合位；
2、PCR扩增：使用上述质粒模板进行PCR扩增，以获得清洁的受体片段；
3、克隆：把扩增片段和质粒模板克隆到同一质粒中，然后克隆到载体存储库中，以创建定向载体用于后续研究。
二、原核转化
1、准备转化粒菌：在装满氯化物的快速离心管中，将转化菌株(一般为质粒转录系) 用冰凉的悬浮液制成2X数量的悬淋液；
2、增加plasmid 质粒：在用有抗生素控制的细菌方法中，增加转换用材料，如plasmid质粒，磷酸二钙和CaC1₂，以及可能的其他试剂；
3、原核转化：将上述的悬浮液（AP出水液）添加到悬淋液中，然后加入CaC1₂和磷酸二钙，用低频超声处理混合液使其充分作用10分钟；
4、选择转化的细胞：将处理过的转化液投入加有抗生素的培养基中，然后将这些细胞培养到辅助抗生素中，以选择转化的细胞，在抗生素抑制剂中，该细胞会死亡；
5、筛选和鉴定：原核基因转换后，体外状态选择一般会获得若干转换抗性的菌株，最终进行PCR、测序或其他方法以鉴定突变体，以确定该菌株具有最终突变基因。
农杆菌转化法原理
农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化，使外源基因被导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。
这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用，为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。
农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤：1. 农杆菌感染植物细胞。
首先，将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中，然后将农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。
2. 植物细胞内基因导入。
农杆菌感染植物细胞后，Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。
这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因，通过农杆菌的介导，成功导入到植物细胞内。
3. 外源基因整合到植物基因组。
一旦外源基因进入植物细胞内，它们会与植物细胞的染色体发生重组，将外源基因整合到植物基因组中。
这样，外源基因就成为植物细胞的一部分，可以被遗传到后代植物中。
4. 外源基因表达。
一旦外源基因整合到植物基因组中，它们就会开始在植物细胞内进行表达。
外源基因的表达可以使植物获得新的性状，比如抗病虫害、耐逆境等，从而实现对植物性状的改良。
农杆菌转化法的原理简单清晰，通过这种方法可以实现对植物基因的改造，为农业生产提供了重要的技术手段。
在实际应用中，农杆菌转化法已经成功应用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆等，为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。
总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理清晰，操作简单，成功率高，因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和完善，相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化是一种常用的基因转移技术，可以将外源DNA导入植物细胞。
下面是农杆菌转化实验的基本步骤：
1. 制备农杆菌：首先，选择适合的农杆菌株，常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens。
接种农杆菌于适宜的培养基中，培养至合适的生长期。
2. 构建质粒：在进行转化实验前，需要构建包含目标基因的质粒。
质粒可以通过常规的分子生物学技术，如PCR扩增、限制性酶切和连接等方法来获得。
3. 准备细菌：将构建好的质粒转化到农杆菌中。
通常采用电穿孔或热激方法，使质粒能够进入农杆菌内。
4. 感染植物：选择适当的植物愈伤组织或幼苗作为接受体，将其暴露在含有农杆菌的培养基中。
农杆菌会侵入植物细胞，并将质粒转移
到植物基因组中。
5. 抗生素筛选：转化后的细菌通常在培养基中含有特定抗生素。
将被转化的植物细胞接种于含有抗生素的选择培养基中，该抗生素能够选择出已转化的细胞。
只有具备目标基因的细胞能够生长并形成抗性。
6. 再生植物：选定抗生素抗性的植物细胞，进一步培养和处理以促进其发育和增殖。
通过激素处理和适当的培养条件，可以使其分化成完整的植株。
7. 验证转化：最后，通过分子生物学技术，如PCR和Southern blot 分析，来确认转化的植物是否成功地获得了外源基因，以及其在植物细胞中的表达。
农杆菌转化实验是一种常用且有效的方法，可用于植物基因工程及改良研究。
通过以上步骤，可以成功将目标基因导入植物细胞中，以获得具有所需性状的转基因植物。
农杆菌转化法介绍
农杆菌感受态制备与转化普通农杆菌感受态制备与转化：方案一1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。
2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。
3. 5k rpm离心5分钟。
4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。
5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。
如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。
6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。
7. 液氮中冷冻1分钟。
8. 37℃水浴溶化细胞。
9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。
10.离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。
11.涂板，28℃培养2-3天。
电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二1. 挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。
（如用5mlYEP，需培养36h）2. 将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。
3. 转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
4. 用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。
5. 4℃，4000rpm离心10min，弃上清。
6. 重复4、5步骤2~3次。
7. 用2ml冰浴的10％甘油重悬。
8. 每管100ul1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。
1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。
注：HEPES需现用现配。
电击法转化农杆菌感受态细胞1. 取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。
2. 加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。
农杆菌转化法的过程
农杆菌转化法的过程农杆菌转化法（Agrobacterium-mediated transformation）是一种广泛应用于农业科学和生物技术研究的基因转化方法。
该方法利用一种土壤细菌，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）将外源基因转移到植物细胞中。
农杆菌转化法具有转化效率高、适用广泛、转基因稳定等优点，已被广泛应用于农作物和果树的遗传改良、抗病抗虫育种等领域。
1.细胞培养首先，需要从植物中获得要进行基因转化的组织细胞（通常是幼苗的果荚或子叶）。
这些组织细胞被培养在含有植物生长激素的富营养培养基中，使其加速分裂和生长。
2.农杆菌培养将农杆菌菌株（通常是含有外源基因的农杆菌株）培养在液体培养基中。
培养基中含有特定的营养物质和抗生素，以促进菌株的生长和维持菌株稳定。
3.动态系统将培养好的植物细胞和农杆菌菌液混合，形成动态系统。
混合液中的植物组织和农杆菌菌株会发生暂时性的融合并进入植物细胞。
4.感染阶段通过共培养或注射等方式，使动态系统中的农杆菌菌株进入植物细胞。
农杆菌会通过特定的受体识别和感染植物细胞。
5.DNA传递一旦农杆菌菌株感染了植物细胞，它会将其含有外源基因的DNA片段传递给植物细胞。
这个DNA片段通常是携带目标基因和选择标记基因的载体。
选择标记基因可以使得转化后的植物细胞在包含选择抗生素的培养基上存活。
6.培养和筛选转化后的植物细胞被转移到含有选择抗生素的培养基中，使得只有携带外源基因的细胞可以生长和分裂。
这样就可以筛选出带有目标基因的转化植物细胞。
7.植株再生将筛选出的转化细胞培养到适当的大小和形态后，再将其转移到含有特定激素的培养基中，以促使其分化为整个植株。
经过适当的培养和生长，就可以获得转基因植物。
总结来说，农杆菌转化法通过将植物细胞和农杆菌菌株进行共培养，使农杆菌将外源基因传递到植物细胞中，然后通过筛选和培养，最终获得转基因植物。
这种方法在农业科学和生物技术研究中具有广泛的应用前景。
农杆菌转化法原理及过程
农杆菌转化法原理及过程
农杆菌转化法是一种常用的基因转化方法，广泛应用于植物基因工程中。
其原理是利用农杆菌中的 Ti 质粒将目的基因导入植物细胞中。
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物。
在感染过程中，农杆菌会将其 Ti 质粒上的 T-DNA（转移 DNA）片段整合到植物基因组中。
T-DNA 上含有多个基因，其中包括生长素和细胞分裂素合成基因，这些基因能够促使植物细胞分裂和生长，从而形成肿瘤。
在基因转化过程中，首先需要将目的基因插入到 Ti 质粒上的 T-DNA 区域中，构建成重组质粒。
然后，将重组质粒导入农杆菌中，使其能够携带目的基因。
接下来，将携带目的基因的农杆菌感染植物细胞，可以通过注射、浸泡或共培养等方式进行。
在感染过程中，农杆菌会将 T-DNA 片段导入植物细胞中，并整合到植物基因组中。
最后，通过筛选和鉴定，获得含有目的基因的转化植株。
农杆菌转化法具有操作简单、转化效率高、适用范围广等优点，是植物基因工程中最常用的方法之一。
但是，该方法也存在一些局限性，如对于某些植物种类转化效率较低、可能引起植物基因组的突变等。
因此，在实际应用中需要根据具体情况选择合适的转化方法。
农杆菌感受态制作和转化
农杆菌感受态制作
1.取保存的菌种，在含相应抗生素的YEB固体培养基上划线，28℃、培养24~36h至长出
单菌落。
2.挑取农杆菌单菌落，接种于5ml含有相应抗生素的液体YEB培养基内。
28℃、250rpm
培养24~36h，至菌液OD600约0.5~0.6
3.按2%体积，将菌液加入含相应抗生素的液体YEB培养基中，28℃、250rpm培养至OD600
为0.5~0.6。
4.4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。
5.加入和扩大培养时培养液相同体积的70mmol/L CaCl溶液，重悬。
6.4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。
7.加入体积为扩大培养时培养液1/10的70mmol/CaCl溶液，重悬。
8.分装为100μL的小分，至于冰上备用。
9.若要冻存，需加入终浓度为15%~20%的甘油。
-80℃冻存。
注：4~9步请注意无菌操作！。
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三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学水平鉴定。农杆菌介导转化法生物技术08-1 梁荣洪
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农 杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA， 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆 菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介 导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应 用。
二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。 根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
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