植物瞬时表达系统的研究进展
高粱品种BTx623原生质体分离及瞬时表达体系的建立
生物资源2021,43(1 ):42〜49Biotic Resources■i f e*-n."it.~c.研究报告DOI ： 10. 14188/j. ajsh. 2021. 01. 006高粱品种BTx623原生质体分离及瞬时表达体系的建立曾弓剑，程云伟，韩少鹏，吕阳，陆业磊，周超，张德春，沈祥陵‘(三峡大学三峡区域植物遗传与种质创新重点实验室/三峡大学生物技术研究中心，湖北宜昌443002)摘要：高粱（Soa/m m&ro/or)是世界上仅次于小麦、水稻、玉米和大麦的重要粮食作物之一，虽然高梁基因组已经完成了测序，但是针对高粱测序品种BTx623,遗传转化方法的缺乏限制了高粱遗传育种和功能基因组研究的发展。
而原生质体瞬时 表达技术，则因为其高效、快速的特性，在功能基因组研究中具有重要的作用。
为了在高粱品种BTx623中建立原生质体瞬时 表达体系，本研究以BTx623幼苗为材料，对原生质体分离过程中的渗透压、酶液成分、酶解时间进行研究。
结果表明：BTx623 幼苗的原生质体分离过程中，最佳酶解液组成为1%纤维素酶、0. 25%离析酶、0. 6 m ol/L甘露醇、10 m m ol/L吗啉乙烷磺酸、1 mmol/LCaCl2、0. 1%小牛血清蛋白和5 mmol/L/?-巯基乙醇，并获得了每毫升1X1CT个的高质量原生质体，所获原生质体活性 在90%以上。
之后利用PEG介导的转化方法，将含有的质粒导人到原生质体中，并通过荧光显微观察统计，遗传转 化率达到（61. 31±3. 91)%。
本研究通过优化高粱品种BTx623原生质体制备及瞬时转化的条件，成功建立了其原生质体瞬时 表达体系，为进一步开展高粱品种BTx623功能基因组的研究奠定了基础。
关键词：高粱；BTx623;原生质体分离；瞬时表达中图分类号：Q943.2 文献标志码：A 文章编号：2096-3491(2021)01-0042-08The establishment of protoplasts isolation and transient expression system ofsorghum cultivar BTx623ZENG Gongjian, CHENG Yunwei, HAN Shaopeng, LU Yang, LU Yelei, ZHOU Chao, ZHANGDechun, SHEN Xiangling(Key Laboratory of Three Gorges Regional Plant Genetics Germplasm Enhancement/Biotechnology Research Center, ThreeGorges University, Yichang 443002, Hubei, China)Abstract：Sorghum is one of the important crops next to wheat, rice, maize and barley in the world, although the sorghum genome has been sequenced, the lack of genetic transformation methods for the sorghum sequenced cultivar BTx623 has limited the development of sorghum genetic breeding and functional genome research. Because of the efficiency and rapidity, the protoplast transient expression technology plays an important role in the research of functional genome. In order to establish the protoplast transient expression system in B Tx623, in this study BTx623 seedlings were used as materials to research the osmotic pressure, composition of enzyme solution and the time of digestion in the process of protoplast isolation. The results showed that in the process of protoplast isolation in BTx623 seedlings, the optimal composition of the enzyme solution is 1% cellulase, 0.25%mecerozyme, 0. 6 mol/L mannitol, 10 mmol/L M ES, 1 mmol/L CaCl2, 0. 1% BSA and 5 mmol/L ^-mercaptoethanol, then IX 107/m L protoplasts with high vitality were ob~收稿日期：2020-09-03 修回日期：2020-10-08 接受日期：2020-12-27作者简介：曾弓剑（1981-),男，硕士生，研究方向为分子植物育种。
实验五、GUS染色检测基因瞬时表达
问题解决能力
实验态度转变
在实验过程中遇到问题时，我学会了独立 思考和团队协作，积极寻找解决方案。
通过认真对待每一个细节，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ培养了严谨 的实验态度和科学精神。
gus染色检测基因瞬时表达的未来发展方向
应用拓展
除了基础研究，gus染色检测基因瞬时表 达在医学诊断和治疗等领域也有广阔的应
用前景。
A 技术优化
01
02
03
研究基因功能
通过瞬时表达技术可以快 速检测特定基因的功能， 了解其在细胞中的作用。
药物筛选
利用瞬时表达技术筛选对 特定基因有调控作用的候 选药物。
基因治疗
瞬时表达技术可用于基因 治疗的研究，为疾病治疗 提供新思路。
02 实验原理
gus染色检测基因瞬时表达的生物学基础
基因瞬时表达
基因瞬时表达是指通过转录和翻译在 短时间内产生大量蛋白质的过程。在 植物和某些微生物中，瞬时表达常用 于研究基因的功能和表达调控。
学习gus染色检测基因瞬时表达的方法
准备实验材料
X-Gluc、缓冲液、DNA转染试 剂、细胞培养板等。
GUS染色
将转染后的细胞用X-Gluc染色 ，观察蓝色产物。
转染DNA
将目的DNA与转染试剂混合， 加入细胞培养板中，使DNA瞬 时表达。
结果分析
根据蓝色产物的多少判断GUS 基因的瞬时表达量。
掌握gus染色检测基因瞬时表达的应用
显色反应
在适宜的温度和pH条件下，GUS酶 催化底物水解，产生蓝色产物。
结果观察
通过观察蓝色产物的生成情况，判断 目的基因是否成功瞬时表达。
03 实验步骤
准备实验材料和试剂
准备所需的gus基因瞬时表 达载体。
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【摘要】A method for transient expression based on Agrobacterium infiltration into cotyledons of Brassica napus L. cv Ningyou 16 was developed with the Green Florescent Protein (GFP) as a marker gene. GFP expression vector pB2GW7. 0-gfp was constructed and transferred into agrobacterium. The addition of P19 protein improved the transient expression level of GFP in cotyledon. Reverse transcription assay showed that GFP was expressed after 4-8 days of agrobacterium infiltration. Confocal microscopical analysis revealed that epidermal cells and guard cells could be transformed by agrobacterium-based transformation method. The entire process only took 20 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this new method is simple and rapid. It has a potential application in dissection genes expression and function in Brassica napus.%实验以甘蓝型油菜宁油16为材料,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,建立了农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统.我们构建了GFP表达载体pB2GW7.0-gfp,并成功转化农杆菌.实验中通过添加P19来提高GFP在油菜子叶中的瞬时表达量.并提取了注射有P19和pB2GW7.0-gfp农杆菌混合液的油菜子叶RNA,经RT-PCR鉴定,发现在4 ～8 d GFP均能表达.激光共聚焦显微镜分析表明农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统能够转化油菜子叶的表皮细胞和保卫细胞.甘蓝型油菜子叶瞬时表达方法简便、快速、可靠,从种子播种到获得荧光蛋白表达,全过程只需要20d.表明在研究油菜基因的表达和功能方面有潜在的应用前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】4页(P93-96)【关键词】甘蓝型油菜;子叶;农杆菌;瞬时表达【作者】谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【作者单位】江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;中国农业科学院油料作物研究所,武汉430062;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013【正文语种】中文【中图分类】Q786油菜在世界各地广泛种植，在油料作物中其产量仅次于大豆与棕榈，位居第三。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（plant transient expression system）是指利用植物细胞暂时转化技术，将外源基因转为至植物体内的高效表达系统。
与其他表达系统（如大肠杆菌、哺乳动物细胞等）相比，植物瞬时表达系统具有以下优势：快速性、低成本、无病原性、可大规模生产等。
近年来，植物瞬时表达系统已经成为植物基因工程领域的研究热点之一。
下面将从基本原理、转化技术、应用以及存在的问题等方面进行综述。
一、基本原理植物瞬时表达系统利用植物组织或细胞中的转化技术（如农杆菌介导转化、雨生病毒等），将外源基因导入植物细胞内。
然后，利用植物体内的植物病毒启动子将外源基因与病毒RNA一同表达，从而实现外源基因的高效表达。
该系统具有以下特点：1）能够同时表达多个外源基因；2）表达水平高且可调控；3）表达时间短暂，MEMS（minutes to hours）级别；4）可以用于植物体内和植物细胞水平的瞬时表达。
二、转化技术1.农杆菌介导转化农杆菌介导转化是当前应用最广泛的一种植物瞬时表达系统。
其基本原理是将外源基因插入至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）植物病原性质粒中，将农杆菌与目标植物细胞接种在一起，通过寄生菌的病理学作用将外源基因成功转化至目标植物细胞中。
该技术具有操作简单、转化效率高等优点。
但是由于农杆菌介导转化仅对部分植物有效，而且对于一些重要物种仍然存在难以克服的技术难题。
2.雨生病毒技术雨生病毒技术是利用雨生病毒有效传播的能力，将外源基因转入植物细胞，然后利用植物体内的病毒启动子进行表达。
由于雨生病毒非常小，可以在分子水平广泛传播，故该技术具有操作简单、适用范围广等优点。
然而，该技术的载体转化量有限，不适用于大规模生产。
三、应用1.基因功能定位植物瞬时表达系统在基因功能定位方面开拓了新的思路。
通过转化不同的融合蛋白并观察它们在植物细胞内的定位，可以快速确认目标蛋白的亚细胞定位，从而为基因功能的深入研究提供良好的方向。
月季花瓣中农杆菌介导的基因瞬时表达体系的优化及其在rnai中的应用
月季花瓣中农杆菌介导的基因瞬时表达体系的优化及
其在rnai中的应用
在植物中通过农杆菌介导的基因瞬时表达和基于RNAi的基因沉默可便捷高效地研究基因功能.本研究采用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)注射侵染法,利用GUS作为报告基因,探讨了月季(Rosahybrida)品种、农杆菌菌株、开花级别、花瓣位置、农杆菌侵染浓度和侵染液成分等因素对月季花瓣中基因瞬时表达效果的影响.结果表明,月季品种蜜糖3级切花的中层花瓣中瞬时表达效果最佳;农杆菌菌株GV3101介导的瞬时表达效果最好,侵染浓度以OD600=0.9为宜,添加10mmol/LMgCl2及10mmol/LMES的侵染液效果优于重蒸水。
同时,利用上述优化瞬时表达体系进行RNAi沉默,成功抑制了外源报告基因GUS和内源基因RhSAG的表达。
相比对照,RhSAG沉默花瓣的萎蔫速度较慢,说明衰老进程得到延缓.该体系的优化为月季花瓣中基因功能的鉴定提供了有效工具。
植物表达系统的应用与发展
植物表达系统的应用与发展植物表达系统（Plant-based expression systems）是一种利用植物作为生物反应器来生产大规模表达目标蛋白的方法。
通过利用植物的生物学特性，以及分子生物学和基因工程技术的快速发展，植物表达系统在生物医药领域得到广泛应用。
本文将探讨植物表达系统的应用和发展，并展望其在未来的前景。
一、植物表达系统的应用领域1. 药物生产植物表达系统被广泛应用于生产重要的药物蛋白。
由于植物具有易于培养、成本低廉、快速扩增等特点，这种方法相对于传统的细胞培养系统具有优势。
例如，植物表达系统已经成功生产了抗体、疫苗、癌症治疗药物等。
这些药物的生产不仅具有高效性和可扩展性，还降低了成本，有助于提高药物的可及性。
2. 功能性食品植物表达系统的另一个应用领域是生产功能性食品。
通过转基因技术，植物可以被改造以产生具有特定功能的蛋白质，如抗氧化物、保健品成分等。
这些功能性食品可以提供人体所需的营养物质，对健康具有积极作用。
3. 环境保护植物表达系统还可以应用于环境保护领域。
通过转基因技术，植物可以被改造成吸收和分解有害物质的特定毒素。
这种方法被称为“植物污染物降解系统”，可以用于处理水和土壤中的污染物，减少对环境的损害。
4. 生物能源植物表达系统在生物能源领域有重要的应用。
通过转基因技术，植物可以被改造成能够产生大量生物燃料的能源作物。
这种方法可以有效利用植物的生物学特性，降低对化石燃料的依赖，减少碳排放，有助于解决能源危机和环境问题。
二、植物表达系统的发展趋势1. 技术创新随着基因工程和分子生物学技术的不断发展，植物表达系统的工艺和技术也在不断创新改进。
新的转基因技术和表达载体的引入，使植物表达系统能够更高效地产生目标蛋白。
2. 品种选择不同的植物种类适用于不同的表达需求。
例如，烟草被广泛应用于植物表达系统，因为它具有高生产能力和易于培养的特点。
随着对植物基因组的深入研究，人们可以更准确地选择适合表达目标蛋白的植物品种。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统是一种可以快速高效地表达外源基因的技术，可以用于植物基因功能研究、农业生物技术等领域。
在过去的几十年里，研究人员不断改进和发展植物瞬时表达系统，使之更加适用于各种不同的植物物种和基因表达需求。
本文将对近年来植物瞬时表达系统的研究进展进行综述。
目前广泛应用的植物瞬时表达系统之一是准双生物系统。
该系统利用无病毒植物（如烟草、洋葱等）叶片中的细胞壁降解酶和激素诱导等技术，将外源基因迅速表达于植物细胞中。
准双生物系统具有表达速度快、适用范围广、表达水平高等优点。
研究人员在该系统中引入了一些改进，如构建了一些特定的表达载体、调整了外源基因的启动子、选择了适合的植物物种等，以提高系统的表达效率和稳定性。
冷冻切片技术是近年来研究人员在植物瞬时表达系统中的一项重要突破。
该技术通过将植物组织或细胞冷冻切片，并在切片上进行DNA或RNA的转染，实现基因的瞬时表达。
冷冻切片技术具有不需要整株植物的特点，可以在实验室中进行快速高效的基因表达研究。
研究人员还进行了一些改进，如优化了冷冻切片的步骤、选择了合适的切片材料和切片工具等，以提高技术的稳定性和可重复性。
一些新兴的基因编辑技术也被应用于植物瞬时表达系统中。
CRISPR/Cas9技术可以精确编辑植物基因组中的特定区域，从而产生目的基因表达变异体。
研究人员在植物瞬时表达系统中引入了CRISPR/Cas9技术，实现了在短时间内快速高效地编辑植物基因组。
这些技术的引入使得研究人员可以更加深入地理解植物基因功能和调控机制。
还有一些基于病毒的植物瞬时表达系统被广泛应用于研究中。
这些基于病毒的系统利用植物病毒的复制和表达机制，将外源基因迅速表达于植物细胞中。
研究人员通过改变病毒载体的结构、优化病毒颗粒的产生条件、调节外源基因的插入位置等方式，提高了病毒介导的基因表达效率和稳定性。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（Plant transient expression system）是一种用植物作为生物反应器来表达外源基因的技术。
相对于传统的植物基因转化技术，植物瞬时表达系统具有操作简单、高效快速、适应性强等优点，因而在植物基因工程研究和产业化应用中得到了广泛应用。
近年来，植物瞬时表达系统在实验室中的应用日益增多，其研究进展也取得了很多重要的突破。
下面将就植物瞬时表达系统的研究进展进行详细的介绍。
一、植物瞬时表达系统的基本原理与方法植物瞬时表达系统是利用植物体内的洋结球病毒、冠状病毒等病毒载体，通过基因枪法、电穿孔法、冻融法等方法将外源基因或者载体转移到植物细胞中，然后通过植物细胞的生物机制来表达这些外源基因。
基本原理是：将目标基因的DNA序列插入病毒载体中，然后将这个病毒载体引入植物细胞，并利用植物细胞自身的转录和转译系统来表达目标基因。
植物细胞内的RNA聚合酶和核糖体可以识别和转录由病毒载体上的启动子引导的目标基因的RNA序列。
当前，植物瞬时表达系统主要包括两种方法：基因枪法（Gene gun method）和冷冻质子法（Cold protonema method）。
基因枪法是一种通过高速微粒束将外源基因转入植物组织或者细胞内的方法。
利用基因枪设备，通过调节高压氦气或者氮气，将导入的DNA颗粒射入目标组织。
该方法可以用于不同的植物组织、细胞和亚细胞的转化，适用性广泛。
而冷冻质子法则是利用电极直接将导入的DNA或RNA质子射向目标组织或细胞的方法。
冷冻质子法可以实现更高的转化效率，并可用于大规模的瞬时表达培养。
近年来，植物瞬时表达系统的研究进展迅速，主要体现在以下几个方面：1. 高效快速的基因转导技术：研究人员通过改进基因枪和冷冻质子等转导技术，提高了基因表达的效率和速度。
通过优化基因枪药剂的配方和冷冻质子的射击参数，可实现更高的表达效率。
2. 外源基因表达的调控：研究人员通过基因工程技术，构建了一系列的响应子集和调控元件，实现了对外源基因表达的调控。
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植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统（PES）是一种用于在植物中快速、高效地表达外源蛋白的技术。
它是基因工程领域中非常重要的工具，被广泛应用于植物基因功能研究、植物生物工程以及
植物疫苗和药物生产等方面。
在过去的几十年里，关于植物瞬时表达系统的研究取得了许
多重要的进展，这些进展在优化表达系统、提高表达效率、缩短表达时间和拓展应用领域
等方面具有重要意义。
本文将介绍植物瞬时表达系统的基本原理、研究进展以及未来的发
展方向。
一、植物瞬时表达系统的原理
植物瞬时表达系统是利用几种不同类型的病毒或细菌，如农杆菌（Agrobacterium），烟草花叶病毒（TMV）和土壤细菌等，将外源基因导入植物细胞中，并在短时间内表达出目的蛋白。
基本的操作流程包括：将外源基因插入载体中，然后将载体转化到病毒或细菌中，最后通过侵染或注射等方式将这些病毒或细菌导入植物细胞内，从而实现外源基因的表达。
相比于转基因植物技术，植物瞬时表达系统具有表达时间短、转化效率高、不易产生突变
和遗传稳定等优点。
它在植物基因功能研究和植物疫苗、药物等生产方面有着广阔的应用
前景。
二、研究进展
1. 优化表达系统
随着对病毒和细菌基因工程技术的深入研究，人们不断优化植物瞬时表达系统，以提
高表达效率和稳定性。
研究人员对载体和表达引物进行了优化，选择了更加适合植物转化
的载体和引物，使得外源基因在植物中的表达更加高效和稳定。
病毒和细菌基因工程技术
的进步也为植物瞬时表达系统的优化提供了更多可能性，不断地推动着这一技术的发展。
2. 提高表达效率
为了提高表达效率，研究人员采用了各种策略，如优化表达条件、改进载体构建和转
化方法、筛选适合的宿主植物等。
利用基因组学、蛋白组学等高通量技术，对植物瞬时表
达系统进行了深入研究，揭示了植物基因表达调控的机制，为提高表达效率提供了理论基础。
3. 缩短表达时间
在研究过程中，人们发现植物瞬时表达系统与传统的转基因技术相比，具有表达时间
短的优势。
为了更好地满足实际应用的需要，研究人员不断尝试缩短表达时间，以提高生
产效率。
他们通过调整病毒或细菌的感染时间、优化培养条件和添加辅助因子等方法，成
功地缩短了植物瞬时表达系统的表达时间，提高了生产效率。
4. 拓展应用领域
除了在植物基因功能研究中的应用外，植物瞬时表达系统还在植物疫苗和药物生产等方面具有广泛的应用前景。
目前，研究人员已经成功地利用植物瞬时表达系统生产了多种疫苗和药物，如乙肝疫苗、抗体药物等。
未来，随着技术的不断发展，植物瞬时表达系统有望在生物制药领域发挥更大的作用，为人类健康和生命健康做出更大的贡献。
三、未来的发展方向
随着对植物瞬时表达系统的研究不断深入，人们对其未来的发展提出了一些新的思考和展望。
人们希望进一步完善植物瞬时表达系统的基本原理，深入探索植物基因表达调控的机制，为提高表达效率和稳定性提供更可靠的理论基础。
人们希望进一步拓展植物瞬时表达系统在生物制药领域的应用，以满足人类健康和生命健康的需求。
人们也在探索将植物瞬时表达系统与其他技术相结合，以提高其在植物功能基因研究和生物制药生产中的应用价值。