亚细胞定位之烟草转化方法
烟草叶肉原生质体分离与转化
烟草叶肉原生质体分离与转化植物原生质体的分离工作起始于上世纪60年代，英国植物病理学家Cooking首次用纤维素酶分离得到植物原生质体，在经过了前人的不断探索和技术创新之后，植物原生质体的分离,培养及转化技术已日渐成熟。
本实验以烟草为材料，进行原生质体分离转化方面的研究。
一、烟草叶肉原生质体的分离1、材料：温室中的烟草与进行无菌培养的烟草均可。
取材时需按以下标准进行：应取生长状态好的较大叶片，表现为颜色墨绿、充分伸展、叶片较为饱满。
若以无菌苗作为材料应注意去掉变黄及生长状态不好的叶片。
（因为无菌苗的叶片常常很小，需要数片叶片才能分离出足够量的原生质体）2、材料预处理。
（此步也可省略，但有关文献中指出预处理可使制得的原生质体活力增强，易于转化）一般将从温室中采来得叶片（通常较大叶片一片足够）在自来水中冲洗10min左右，（动作要轻微，防止弄伤叶片），然后用保鲜膜包好，置于4℃ 6-12小时。
（一般过夜）3、消毒。
将预处理过的叶片用剪刀小心剪成10mm2大小，置于盛有0.1%升汞的大培养皿中，浸泡8-10min。
再用无菌水冲洗4-5遍。
（放入叶片前，可在0.1%的升汞中加入几滴Tween20，用枪吹打混匀）4、酶解。
将消毒过的叶片用镊子夹取平放于灭菌的滤纸上，若使用无菌苗叶片，需用拇指与中指按住两端，右手拿单面保险刀片从叶片中间部位横切，将叶片切成0.5-1mm左右的细丝，然后立即用镊子将切好的叶片转入预先培好的酶液。
若使用温室苗的叶片，则需将消毒过的叶片平放于灭菌滤纸上，背面朝上，用左手固定住叶片，右手用尖头镊子小心撕去下表皮，后迅速转进酶液，背面朝下。
(注：切成细丝或撕去下表皮的叶片应马上转移入酶液)5、酶解处理。
不同搭配的酶液的最适温度与酶解时间各异。
实验发现烟草叶肉原生质体分离的最适酶液搭配为：cellulaseR-10. Macerozyme R-10.最适温度与酶解时间：26℃避光3-4h。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
烟草瞬时表达步骤电子版
烟草瞬时表达步骤电子版亚细胞定位准备(用烟草ck)MS无抗培养基倒平皿，铺二层滤纸于培养基上；吸水纸（卫生纸一卷），小滤纸，用10ml 离心管代替打孔器，50ml离心管；小三角瓶（均需要灭菌，115℃，30min）1.将保存的农杆菌划线（kan+rif）,第三天中午挑菌于（kan+rif）LB培养基中28-30℃，摇床20h至第四天早上；2.以1:25比例（1ml接种于25ml）接菌液于25mlLB(含kan+rif，50nmAS)28-30℃，摇床培养至OD=0.6-0.8，约5h。
3.用50mL离心管收集菌体，常温，5000rpm，离心5min,弃上清；4.用以下溶液重悬菌体等体积25ml(10mM MgCL2，10mM MES, 150nM AS)放入小三角瓶，室温下静置活化2h，（铺滤纸于已凝的无抗MS培养基）；5.将叶片打孔，圆状的叶片浸泡在菌液中，真空渗透30min-1h （0.85Mpa）。
6.用灭菌的吸水纸吸干表面的菌液，平铺放置于MS培养基上，光照培养48h。
7.观察。
GUS定量分析所用试剂：1、0.1M磷酸缓冲液）（pH7.0）1M Na2PO4 11.54ml1M NaH2PO4 8.46mlAdd ddH2O TO 200ml2、GUS 蛋白提取液 (现用现配)0.1M磷酸缓冲液（pH7.0） 100ml10% SDS 2ml0.5M EDTA(Ph8.0) 4mlTritonx-100 200ulβ-巯基乙醇 200uladd ddH2O TO 200ml121℃灭菌室温保存3、gus蛋白分析buffer每100ml的蛋白提取液加入4-MUG 70.46mg,-20℃保存，现配现用。
4、0.2M Na2CO3 buffer。
Gus蛋白提取方法（全过程于冰上操作）取适量烟草叶片，加入适量PVP,加液氮研磨成粉末，取约0.6g装入15ml离心管中?预先加入500ml蛋白提取液，摇匀，在冰上放置置沉淀4℃，13000prm离心15min.吸取上清到另一管中进行下一步实验，（未及时做放-20℃）Gus活性测定取20ul蛋白加入37℃预热的180ulgus 蛋白分析buffer中，37℃温浴。
烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析
烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析李尊强;王春军;杨爱国;丁安明;冯全福;徐剑;焦惠鹏;高堃宇【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(000)030【摘要】[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析.[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况.[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP 融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达.[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据.【总页数】4页(P11957-11960)【作者】李尊强;王春军;杨爱国;丁安明;冯全福;徐剑;焦惠鹏;高堃宇【作者单位】牡丹江烟草科学研究所,黑龙江牡丹江157011;牡丹江烟草科学研究所,黑龙江牡丹江157011;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;中国农业科学院烟草研究所,烟草行业烟草基因资源利用重点实验室,山东青岛266101;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100;哈尔滨烟叶公司肇东分公司,黑龙江肇东151100【正文语种】中文【中图分类】S572【相关文献】1.东方百合‘演员’DXS基因的克隆与表达分析 [J], 张浩宇;樊俊苗;王婷;杜方2.烟草氧化胁迫相关基因NtOSA1的克隆表达及亚细胞定位分析 [J], 刘继恺;高永峰;吴婵娟;张林;陈彩霞3.马铃薯StPSKRs基因的克隆及其亚细胞定位分析 [J], 卢瑶; 胡金雪; 金鑫; 陈越; 陈勤; 卢海彬4.薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达 [J], 龚林涛;苏秀娟;尹松松;孙明辉;闫博文;阿迪莱·阿布都热依木;陈全家5.枳两个GRAS基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析 [J], 李阿英;刘洪;李晓颖;郭磊;宋长年因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
六种病毒外壳蛋白亚细胞定位及对烟草抗性影响的比较分析
六种病毒外壳蛋白亚细胞定位及对烟草抗性影响的比较分析植物病毒病是仅次于真菌病害的第二大病害,严重危害重要的经济作物和粮食作物,并且危害程度逐年加重。
随着基因工程的迅速发展,抗病育种成为防治病毒病的有效手段之一。
其中应用最为广泛的是利用病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因转化植物,使其获得抗性,这与病毒外壳蛋白基因组结构、功能及在细胞中的定位有一定的联系。
不同病毒的CP在病毒的侵染过程中所起的作用不同,其在植物细胞中的亚细胞定位和引起植物产生的抗性也应该不同。
因此,本文比较分析了本实验室目前所有的共计六种病毒的CP亚细胞定位及瞬时表达对植物的影响,以期为更详细的理解不同病毒CP在病毒致病中的作用及不同病毒CP在诱导植物产生抗性中的作用提供更多的依据。
六种病毒分别是烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)。
本文根据Genebank中五种病毒外壳蛋白全长设计含酶切位点的引物,以RNA 为模板,PCR扩增外壳蛋白全长,插入载体中间pSAT1-EGFP-C1或pSAT6-EGFP-N1上,利用PCR筛选及酶切鉴定得到中间重组载体质粒,再用PI-PSP I或ASC I单酶切,插入到最终植物表达载体pPZP-RCS1,同样利用PCR筛选及酶切鉴定得到含CP的重组克隆,用冻融法将重组克隆(其中TMV CP的植物表达载体已在本实验室前期完成)导入根癌农杆菌EHA105,菌液PCR及酶切鉴定证明质粒均已成功导入根癌农杆菌EHA105中。
用根癌农杆菌介导的瞬时表达观察它们在本氏烟、云烟中的亚细胞定位,进行初步的比较分析。
烟草亚细胞定位
烟草亚细胞定位亚细胞定位是现代生物学研究的重要领域之一。
它通过对细胞内各种分子的运动和分布进行观察和分析，揭示了细胞内分子交互作用的复杂性和多样性。
烟草作为一种常见的植物，也是亚细胞定位研究的重要对象之一。
本文将从烟草亚细胞结构、亚细胞定位技术以及烟草亚细胞定位的研究进展等方面进行探讨。
一、烟草亚细胞结构烟草细胞是一种典型的植物细胞，由细胞质、细胞核、质膜、细胞壁、线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、核糖体和微管等多个不同的结构组成。
其中，细胞核是细胞的重要组成部分，包含着遗传信息和调控机制。
质膜是细胞的外层结构，维持着细胞内外环境的稳定。
细胞壁是细胞的支撑结构，保护细胞不受外界环境的侵害。
线粒体是细胞内能量的主要来源，参与细胞的呼吸作用。
叶绿体是植物细胞的特征性结构，参与光合作用。
高尔基体和内质网是细胞内蛋白质合成和转运的重要场所。
核糖体是细胞内蛋白质合成的基本单位。
微管是细胞内的一种细胞骨架，参与细胞的形态维持和运动。
二、亚细胞定位技术亚细胞定位技术是研究细胞内分子运动和分布的重要手段。
目前常用的亚细胞定位技术主要包括荧光显微镜技术、电子显微镜技术、蛋白质标记技术和基因工程技术等。
其中，荧光显微镜技术是最常用的亚细胞定位技术之一。
它利用荧光染料或荧光蛋白对细胞内分子进行标记，通过荧光显微镜观察细胞内分子的运动和分布。
电子显微镜技术则可以观察到更高分辨率的细胞结构和分子分布。
蛋白质标记技术和基因工程技术则可以对分子进行精确的定位和操作，提高亚细胞定位的精度和可靠性。
三、烟草亚细胞定位研究进展烟草作为一种常见的植物，其亚细胞定位研究也有着广泛的应用和深入的研究。
近年来，烟草亚细胞定位研究主要集中在以下几个方面：1.烟草亚细胞蛋白质定位烟草中有大量的蛋白质参与细胞的生长和发育过程。
通过荧光蛋白标记技术和基因工程技术，可以对这些蛋白质进行定位和操作。
研究表明，烟草细胞质内的微管蛋白可以定位在微管上，参与细胞的形态维持和运动。
亚细胞定位方法
亚细胞定位方法随着分子生物学的发展，人们对于细胞内分子的定位也越来越感兴趣。
亚细胞定位方法就是用来确定细胞内分子在细胞中的位置的一种方法。
本文将介绍几种常用的亚细胞定位方法。
1. 免疫荧光染色法免疫荧光染色法是一种常用的亚细胞定位方法。
该方法利用特异性抗体与目标分子结合，然后再用荧光标记的二抗或直接荧光标记的一抗来检测目标分子的位置。
这种方法可以用来确定细胞内蛋白质、核酸、糖等分子的位置。
该方法的优点是速度快、灵敏度高，可以同时检测多种分子的位置。
2. 蛋白质标记法蛋白质标记法是一种通过标记蛋白质来确定其位置的方法。
该方法可以利用荧光染料、酶标记物或放射性同位素等标记蛋白质，然后用特异性抗体来检测标记的蛋白质的位置。
该方法的优点是可以直接标记蛋白质，不需要额外的抗体，因此可以减少非特异性结合的问题。
3. 基因标记法基因标记法是一种通过将目标分子的基因进行标记来确定其位置的方法。
该方法可以利用绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)等标记基因来标记目标分子，然后用荧光显微镜来观察目标分子的位置。
该方法的优点是可以直接标记目标分子的基因，不需要额外的抗体，因此可以减少非特异性结合的问题。
4. 电子显微镜法电子显微镜法是一种通过电子显微镜来观察细胞内分子位置的方法。
该方法可以利用金标记或碳标记的抗体来标记目标分子，然后用电子显微镜来观察目标分子的位置。
该方法的优点是可以观察到分子的超微结构，但缺点是需要非常高的分辨率，因此需要专业的设备和操作技术。
5. 光学显微镜法光学显微镜法是一种通过光学显微镜来观察细胞内分子位置的方法。
该方法可以利用荧光染料、荧光蛋白等标记分子，然后用光学显微镜来观察目标分子的位置。
该方法的优点是成本低、易于操作，但缺点是分辨率较低，只能观察到分子的大致位置。
总结亚细胞定位方法是一种用来确定细胞内分子位置的重要方法。
不同的方法有其各自的优缺点，需要根据实验需要选择合适的方法。
烟草转化方案
利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。
同时，还可以检测蛋白的表达量。
这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。
通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。
2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。
3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。
4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。
5. 室温放置2-3h后注射烟草。
6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。
注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。
7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。
8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。
同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。
配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。
2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。
3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。
5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。
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本氏烟草N. benthamian瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌;
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜;
估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率;
3、当菌液OD值介于~之间时,1000g,5min离心收集农杆菌;
4、用2ml Induction medium without AS轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液;
5、重复步骤4;
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬;
7、室温放置1~4小时
8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液组合详见下文;
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中;
使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染;
B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装避免反复冻融,-20℃;
用高压灭菌的超纯水稀释;
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达;严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过;
D、关于侵染液浓度：
推荐每个菌株的浓度在~之间;过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎;。