EMSA、CHIP.亚细胞定位
免疫印迹技术
离心收集
定量检测
细胞加入裂解 液冰上放置 10-15分钟
高速离心收集 上清即得全蛋 白样本
蛋白定量和 SDS-PAGE 检测
1、组织或细胞破碎
? 机械匀浆 组织分散机、玻璃 ? 超声破碎 ? 反复冻融
干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解， 反复操作 ? 低渗溶液 ? 去污裂解液
表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及 胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离 子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60及吐温80）等。
基本概念
? 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
? 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片 段的方法，称为Southern印迹法。
? 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析， 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后 的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电 泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
抑制蛋白酶及磷 酸酶
可以适量加入甘 油,稳定蛋白
注意事项
使用的 Detergent 的种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 酶,去除DNA,充 分提取蛋白,降 低提取的粘度 .?裂解源自的用量细胞或组织的样 本量
Temperature 试剂和器皿冰上 预冷,低温4℃操 作
2、细胞裂解液
缓冲液
表面活性剂
其它：H2O、NaCl 、等
RIPA Buffer
关于转录因子,我们都有哪些疑问？
本文为《园艺研究》作者分享会【园艺作物转录因子】的文字整理版，本次作者分享会邀请了中国农业大学的傅达奇副教授，高颖博士，范中奇博士与作者交流群中2400多人进行了热烈的交流讨论。
1.您好，请问比较两种植物的抗性的话，如果A植物中与抗性相关的转录因子比如myb表达量和表达数目在胁迫过程中上调或变多的幅度大，是不是说明它更有耐性。
然后结合生理指标作出说明就可以了？答：总的来说，研究植物抗性一般以植株的抗逆表型作为主要参考，基因的表达量可以作为辅助说明。
比如通过表型说明a植物比b植物在更强的抗性胁迫条件下存活，或者说明在同一胁迫条件下a比b长势好。
基因表达量在胁迫过程中上调并不能直接说明问题，例如同样是受到叶片衰老和植物激素ABA 诱导的NAC转录因子，超表达RD26或ORE1则加速叶片衰老而超表达JUB1则抑制叶片衰老。
另外，研究某一基因的具体功能，最好的就是通过转基因途径，例如把MYB超表达后、或者同源突变后，观察抗性基因的表型，才能最准确的确定该MYB在胁迫过程中是正还是负调控因子。
2. 老师您好，请问目前果树研究中比较适合western blot和ChIP实验的标签有哪些，您一般选择怎样的标签？谢谢老师。
答：关于标签的选择不能一概而论，最好通过预实验来选择合适的标签，因为在不同的物种甚至是把标签连到目的蛋白的N端和C端都可能会出现不同的情况。
我们会在构建基因表达载体时同时构建多种不同标签以及把标签分别连到目的蛋白的N端和C端，在本氏烟草中进行瞬时表达来筛选出适合的标签，但这也只能作为参考，因为在不同植物中因为蛋白质高级结构不同也可能存在标签在烟草中裸露但在其他物种中却被包裹而检测不到的情况。
3.（1）.反向遗传学中，如何确定一个基因属于转录因子？（2）.如何确定转录因子的功能？（3）.转录因子的功能和其基因表达量的关系？答：（1）首先可以在植物转录因子数据库（/）中查找你的目的基因或者在NCBI中通过序列比对，初步确定其所属的转录因子家族，然后通过氨基酸序列比对以及蛋白质结构预测等方法确定其是否含有该转录因子家族特有的结构域。
emsa实验原理
EMSA实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与核酸（一般是DNA）之间的相互作用。
该技术通过观察蛋白质-核酸复合物在凝胶电泳中的迁移率变化，可以揭示蛋白质与DNA结合的情况。
实验原理在EMSA实验中，首先需要准备一定浓度的DNA片段，通常是已知序列的DNA探针。
接着，将待检测的蛋白质与这些DNA探针一起混合，形成蛋白质-核酸复合物。
随后，将这些混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。
在凝胶电泳过程中，如果DNA片段没有与蛋白质结合，那么它们将会沿着电场方向运动到特定位置。
但是，如果DNA片段与蛋白质结合形成复合物，则复合物的迁移率会受到影响，迁移速度将会减慢。
结果就是在凝胶中观察到不同带电簇的出现，这些带电簇代表了不同的蛋白质-核酸复合物。
通过对凝胶电泳结果进行分析，可以确定哪些蛋白质与DNA结合，并且可以定量检测它们之间结合的强度和亲和力。
这样的信息对于理解蛋白质功能以及基因调控机制至关重要。
实验步骤1.制备实验样品：准备已知序列的DNA探针和待检测的蛋白质溶液。
2.形成蛋白质-核酸复合物：将DNA探针和蛋白质混合，在合适的条件下形成复合物。
3.加载到凝胶中：将混合物加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
4.电泳分离：在合适的电场作用下，观察蛋白质-核酸复合物的迁移情况。
5.结果分析：分析凝胶电泳结果，确定蛋白质-核酸复合物的形成情况以及强度。
结论EMSA实验是一种简单有效的方法，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该实验，可以揭示蛋白质在基因调控中的作用，帮助科研人员深入理解这些生物大分子之间的相互作用机制。
EMSA技术在基因编辑、药物研发等领域有着广泛的应用前景，对于推动生命科学的发展起着重要作用。
酵母基因组学与亚细胞定位技术研究
酵母基因组学与亚细胞定位技术研究酵母是一个广泛存在于自然界中的真核生物，它在基因调控、代谢调节、蛋白质合成等方面具有非常重要的应用价值。
而酵母基因组学与亚细胞定位技术研究是酵母研究领域中的两个非常重要的方向。
本文将从定义、发展、应用等方面进行探讨。
一、酵母基因组学的定义和发展酵母基因组学是一门研究酵母基因组结构、功能和进化的学科，是现代生命科学中颇受关注的研究方向之一。
在酵母基因组学领域，我们可以分为酵母基因组测序、基因组注释、基因组比较以及基因组功能分析等几个方面。
自从酵母基因组被测序以来，酵母研究进展迅猛，并早已成为生命科学中的一个重要实验模型系统。
酵母基因组学的发展历程可以追溯到上世纪70年代。
当时，酵母遗传学家Chang和Lehtinen提出了酵母遗传图谱概念，这是酵母基因组学起步的标志。
1980年代，美国Drs. Peter Lobban和Gerald Fink在优酵母Saccharomyces cerevisiae中以特异性探针的方式分离得到10个不同的核型，开创了酵母分子细胞学的先河，促进了酵母研究的发展。
1996年，酵母基因组计划正式启动，美国和日本先后在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae上完成了细胞核基因组测序，并随后陆续完成了其他酵母物种的基因组测序。
酵母基因组学的测序技术极大地促进了生命科学的进展，并在很大程度上推动了基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等研究的发展。
二、亚细胞定位技术的定义和发展亚细胞定位技术是一种研究细胞内生物分子定位和功能的技术。
通过确定细胞内蛋白质、核酸、代谢产物等的定位，可以进一步理解细胞功能和代谢调节的机理。
亚细胞定位技术的方法非常多样化，包括免疫荧光技术、多光子显微术、原子力显微术、电子显微术等多种技术手段。
相比于传统的细胞学技术，亚细胞定位技术能够以更高的分辨率观察生命体系中分子的定位和运动，因此在生物医学、药物研究和遗传疾病诊断等领域有着重要的应用价值。
凝胶迁移实验(EMSA)看这篇就够了!
凝胶迁移实验（EMSA）看这篇就够了！概念EMSA 称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测，是一种用于研究转录因子和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，能对各类转录因子的 DNA 结合活性进行定性和半定量分析，是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。
这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
原理EMSA 主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。
根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针有互作。
分类同位素标记探针特点：特异性强、敏感性高达到10-18mol水平，对操作人员身体有害非同位素标记探针------应用最为广泛特点：无需放射显影，采用生物发光或化学发光原理。
灵敏度高，信号强EMSA的特异性常用实验技术中免疫组化、免疫印迹 ( WesternBlotting) 和 EMSA 均可用于转录因子检测，但三者的侧重点各有不同。
免疫组化或免疫荧光技术可以较准确的反应转录因子的表达部位和表达细胞， Western Blotting 可以精确定量转录因子。
但并非所有转录因子均可以与 DNA 结合以刺激基因转录，唯有EMSA 技术可以反映转录因子是否具有 DNA 结合活性，故 EMSA 是证明细胞信号转导通路最终效应的必要实验技术。
实验步骤（步骤来源与网络仅供参考）探针的标记①:探针标记的反应体系(1.75pmol/μl) 2μlT4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1μlNuclease-Free Water 5μl[γ-32P]ATP (3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1μlT4 Polynucleotide Kinase (5-10u/μl) 1μl总体积10μl②:使用水浴或PCR仪37℃反应10min.③:加一定体积的终止液、混匀、终止探针标记.④:加入一定体积的TE、混匀.探针的纯化(视情况定）对于100μl标记好的探针，加入一定量的醋酸铵和无水乙醇在-70℃沉淀1h或在-20℃沉淀过夜在4℃12000g-16000g 离心30min 弃上清在4℃12000g-16000g 离心1min、吸去残余液体加入一定体积的 TE ,使沉淀溶解探针使用时间一般不超过3天，保存在-20℃实验中常见的问题：1、为什么看不到迁移带？1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。
emsa探针设计原则
EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种用于研究蛋白质与DNA 相互作用的实验技术。
在EMSA实验中，DNA与蛋白质结合形成复合物后，由于蛋白质的结合，DNA的迁移速度减缓，从而产生电泳迁移的变化。
设计EMSA 探针时，需要考虑一些原则以确保实验的有效性和准确性。
以下是一些EMSA探针设计的原则：1. DNA序列选择：-选择包含蛋白质结合位点的DNA序列。
-序列长度通常在20到30个碱基对之间。
2. GC含量：-控制DNA探针的GC含量，使其在40-60%之间，以确保适当的二级结构形成。
3. 端标记：-选择适当的标记方法，如放射性同位素标记（如^32P）或非放射性标记（如荧光标记或生物素标记）。
-注意标记效率和探针稳定性。
4. 双链DNA vs. 单链DNA：-双链DNA探针更接近实际生物条件，但单链DNA可能更容易与蛋白质结合。
-根据实验需求选择双链或单链DNA。
5. 非特异性竞争：-添加非特异性竞争DNA片段可以用于确认蛋白质结合的特异性。
-非特异性竞争物质的浓度需要经过优化。
6. 核苷酸突变：-引入特定核苷酸的突变以确认蛋白质结合的特异性。
-突变的核苷酸位置需要根据先前的研究或生物信息学分析来选择。
7. 探针浓度：-确定适当的DNA探针浓度，通常需要进行一系列的浓度测试以确定最佳条件。
8. 探针纯度：-使用纯度高的DNA探针，以避免非特异性结合或其他干扰。
9. 探针长度：-考虑探针的长度，太长可能影响迁移速度，太短可能不足以与蛋白质结合。
10. 实验条件优化：-需要优化电泳条件，如凝胶浓度、电场强度、电泳时间等，以确保蛋白质- DNA复合物和未结合的DNA可以明显分离。
设计EMSA探针时需要根据具体的实验目的和条件进行调整和优化。
在实验过程中，注意控制实验的质量和可重复性，以获得可靠的结果。
EMSA技术的原理
EMSA技术的原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）技术是一种常用的生物学实验方法，用于研究蛋白质与核酸相互作用的原理。
该技术可以测定核酸结合蛋白的结合亲和性和特异性。
下面将详细介绍EMSA技术的原理。
EMSA技术的原理基于核酸与蛋白质相互作用的电泳迁移差异。
在该实验中，核酸分子（DNA或RNA）与特定的蛋白质结合形成复合物，从而改变了核酸分子的电泳迁移性。
这种差异可以通过电泳分离和检测来观察和分析。
EMSA技术的主要步骤包括以下几个方面：第一步是制备探针。
通常使用核酸探针来进行EMSA实验。
探针可以是标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA分子。
这些探针通常具有与目标蛋白质结合的特定序列。
第二步是制备样品。
样品通常包括目标蛋白质和核酸探针。
目标蛋白质可以是从细胞提取的总蛋白质，也可以是经过纯化的特定蛋白质。
核酸探针和目标蛋白质在适当的缓冲液中混合，形成复合物。
第三步是电泳分离。
样品中的复合物和未结合的核酸探针通过电泳在聚丙烯酰胺凝胶中分离。
由于复合物的存在，复合物的电泳迁移速度较慢，而未结合的核酸探针的电泳迁移速度较快。
第四步是转移和固定。
在电泳分离之后，核酸分子被转移到固定在膜上的凝胶上。
这一步可以通过将凝胶与膜进行转移来完成。
第五步是探针的探测。
转移后的凝胶上的核酸探针可以使用适当的方法进行探测。
常用的方法包括荧光染色、放射性探测和化学发光等。
EMSA技术的原理基于核酸与蛋白质相互作用的电泳迁移差异，通过核酸探针与目标蛋白质结合形成复合物，从而改变了核酸分子的电泳迁移性。
这种差异可以通过电泳分离和探测来观察和分析。
EMSA技术在研究蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用、转录调控、信号传导等方面具有广泛的应用。
它可以帮助科学家们更好地理解生物学过程以及相关疾病的发生机制，为新药的开发和治疗提供有力的依据。
蛋白质的亚细胞定位
蛋白质的亚细胞定位一、前言蛋白质是细胞中最基本的分子，也是生命活动的重要组成部分。
蛋白质在细胞内的亚细胞定位是细胞内物质运输和代谢的关键环节，对于研究细胞生物学和生物医学具有重要意义。
二、亚细胞定位简介亚细胞定位指的是蛋白质在细胞内的位置。
根据蛋白质在细胞内的位置不同，可以将其分为四类：核内、质膜下、内质网上和线粒体上。
三、核内定位核内定位指的是蛋白质存在于核内。
这类蛋白质通常具有DNA结合能力或者参与转录调控等功能。
常见的核内定位信号包括核定位信号（NLS）和核出口信号（NES）等。
四、质膜下定位质膜下定位指的是蛋白质存在于细胞质与细胞外之间。
这类蛋白通常涉及到外泌作用或者参与到信号转导等过程中。
常见的质膜下定位信号包括信号肽和膜锚等。
五、内质网上定位内质网上定位指的是蛋白质存在于内质网上。
这类蛋白通常涉及到蛋白质的翻译后修饰、折叠和组装等过程中。
常见的内质网上定位信号包括信号肽和KDEL序列等。
六、线粒体上定位线粒体上定位指的是蛋白质存在于线粒体上。
这类蛋白通常涉及到线粒体能量代谢和呼吸链等过程中。
常见的线粒体上定位信号包括信号肽和预序列等。
七、亚细胞定位与疾病关系亚细胞定位异常可能导致一些疾病，例如：淀粉样前体蛋白（APP）在细胞内部分布异常可能会导致阿尔茨海默氏病；错配合基因1（BMPR1A）在细胞外分布异常可能会导致多发性息肉症。
八、总结亚细胞定位是蛋白质功能发挥的关键环节，不同位置的蛋白具有不同的功能。
通过研究亚细胞定位，可以深入了解蛋白质的功能和生理学过程，为疾病治疗提供新的思路和途径。
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EMSA实验材料：EMSA探针生物素标记试剂盒（20；1358）；化学发光EMSA检测试剂盒（100；1399）；正电尼龙膜（20；458）；细胞核蛋白提取试剂盒（50；462）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（200；170）；压片暗盒（1个；138）；PMSF试剂（1g;118）实验方法：一、探针制备：1.准备工作：A.取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。
B.取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。
如果待标记的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA 探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA探针浓度为0.5μM。
2.DNA 探针的标记:Ultrapure water 29ulTdT Buffer (5X) 10ul待标记探针(1μM) 5ulBiotin-11-dUTP (5μM)5ulTdT (10U/μl)1ul总体积50ulA.参考上表设置反应体系。
注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
B.用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。
37℃孵育30分钟。
C.加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
3.TdT 的去除:A.探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。
B.12000-14000g离心1-2分钟。
吸取上清备用。
上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
4.探针的纯化( 选做) ：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。
有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。
如需纯化，可以按照如下步骤操作：A.对于100μl 标记好的探针，加入1/4体积即25μl 的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl 的无水乙醇，混匀。
B.-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。
C.4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。
小心去除上清，切不可触及沉淀。
D.4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。
小心吸去残余液体。
微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
E.加入50μl TE，完全溶解沉淀。
标记好的探针可以-20℃保存。
5.生物素标记探针标记效率的检测：A.取5μl Biotin-Control Oligo (0.4μM)，加入196μl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-ControlOligo(作为标准品)。
取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
B.取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μl TE，混匀，稀释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。
取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
C.参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。
对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取2μl滴加到膜上。
在膜上滴加标准品或待测样品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。
说明：如果条件许可，可以使用专门用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针的用量参考下表，浓度可以再稀释50倍，而所用体积可以相应放大50倍至100μl。
探针浓度10nM 5 nM 2.5 nM 1 nM 0.5 nM 0.25 nM Biotin-Control Oligo 2ul 2ul 2ul 2ul 2ul 2ul生物素标记的探针2ul 2ul 2ul 2ul 2ul 2ul 探针量20 fmol 10 fmol 5 fmol 2 fmol 1 fmol 0.5 fmolD.滴加完所有的标准品和样品后，将膜室温晾干。
E.用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm 2 ，交联30-45秒。
如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪( EUV002 ))，距离膜5-10厘米左右照射1-5分钟。
也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射1-10分钟。
最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
F.随后可以立即采用各种生物素检测试剂盒，检测出样品的生物素标记效率；也可以室温存放数天直至进行后续检测。
G.如果最后采用的是ECL类试剂或其它类似试剂进行检测，则可以对比样品和标准品的灰度，从而计算出探针的标记效率。
例如2fmol量的待测样品探针的灰度和1fmol 标准品的灰度相同，则说明探针的标记效率大致为50%，待测样品中总探针的浓度约为1μM，而实际被生物素标记的探针约为0.5μM。
探针的标记效率也可以通过建立标准曲线进行比较精确的计算。
用于后续检测时通常要求标记效率不低于30%。
有文献报道标记效率和3’末端的碱基无关，但和整个待标记探针的序列有关。
由于在TdT的催化下可以在待标记探针的3’端加上多个Biotin标记的dUTP，因此有时会出现标记效率大于100%的情况。
6.生物素标记EMSAA.对于步骤3B标记好的单链DNA探针，把正义链和反义链等体积混合(不可根据标记效率调整摩尔比例)。
对于最初使用变性的双链EMSA探针进行探针标记的情况，直接进入下一步.B.加入退火缓冲液(10X)，使退火缓冲液的最终浓度为1X，混匀。
例如待退火探针的体积为100微升，则加入11微升退火缓冲液(10X)。
C.如下设置PCR仪进行退火反应：步骤温度时间说明1 95℃2分钟让oligo充分变性2 每8秒下降0.1℃，降至25℃(注1) 约90分钟退火3 4℃长时间保持暂时存放注1：如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能，也可以设置为每90秒下降1℃。
D.退火反应结束后，-20℃保存标记好的EMSA探针。
此时的EMSA探针已经可以直接用于后续的EMSA检测，也可以对探针进行适当纯化后再进行EMSA检测。
二、核蛋白提取1.准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。
取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2.对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。
离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
3.对于悬浮细胞：用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
4.每20微升细胞沉淀加入200 微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。
(对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。
)5.最高速剧烈Vortex 5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。
(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。
)6.冰浴10-15分钟。
7.加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10 微升。
最高速剧烈Vortex 5秒，冰浴1分钟。
8.最高速剧烈Vortex 5秒，4ºC 12,000-16,000g离心5分钟。
9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。
可以立即使用，也可以冻存。
(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。
)10.对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50 微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。
(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。
)11.最高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。
然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒，共30分钟。
12.4ºC 12,000-16,000g离心10分钟。
13.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。
可以立即使用，也可以-70ºC冻存。
14.对于新鲜组织：A.把组织尽可能切成非常细小的碎片。
按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。
并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。
按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。
匀浆需在冰浴或4ºC进行。
B.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。
C.4ºC 1,500g离心5分钟。
把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。
(吸上清时千万不要触及沉淀。
)D.对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。
接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。
抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14c中抽提得到的细胞浆蛋白合并。
三、EMSA 胶的配制A.准备好倒胶的模具。
可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适当的模具。
最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。
为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。
制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
B.按照如下配方配制20ml 4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
TBE buffer (10X) 1 ul重蒸水16.2 ul39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2 ul80% 甘油625 ul10% 过硫酸铵(ammonium persulfate) 150 ulTEMED 10ulC.按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。
避免产生气泡，并加上梳齿。
如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
四、EMSA 结合反应：A. 如下设置EMSA结合反应：阴性对照反应：Nuclease-Free Water 7 ulEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2 ul细胞核蛋白或纯化的转录因子0 ul标记好的探针 1 ul总体积10 ul样品反应：Nuclease-Free Water 5 ulEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2 ul细胞核蛋白或纯化的转录因子 2 ul标记好的探针 1 ul总体积10 ul探针冷竞争反应：Nuclease-Free Water 4 ulEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2 ul细胞核蛋白或纯化的转录因子 2 ul未标记好的探针 1 ul标记好的探针 1 ul总体积10 ul突变探针的冷竞争反应：Nuclease-Free Water 4 ulEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2 ul细胞核蛋白或纯化的转录因子 2 ul未标记的突变探针 1 ul标记好的探针 1 ul总体积10 ulSuper-shift反应：Nuclease-Free Water 4 ulEMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2 ul细胞核蛋白或纯化的转录因子 2 ul目的蛋白特异抗体 1 ul标记好的探针 1 ul总体积10 ulB. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。