外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
蛋白质的表达、纯化及检测-分子实验报告
实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。
在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。
2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。
3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。
考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。
考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测
SDS-PAGE分离蛋白原理
组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离 而带Байду номын сангаас，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的 性质及溶液的pH值和离子强度。
聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加 速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的 作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中 受电场的作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状 结构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电 荷的多少和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不 同，可将不同的蛋白质进行分离。
进 入 夏 天 ，少 不了一 个热字 当头， 电扇空 调陆续 登场， 每逢此 时，总 会想起 那 一 把 蒲 扇 。蒲扇 ，是记 忆中的 农村， 夏季经 常用的 一件物 品。 记 忆 中 的故 乡 ， 每 逢 进 入夏天 ，集市 上最常 见的便 是蒲扇 、凉席 ，不论 男女老 少，个 个手持 一 把 ， 忽 闪 忽闪个 不停， 嘴里叨 叨着“ 怎么这 么热” ，于是 三五成 群，聚 在大树 下 ， 或 站 着 ，或随 即坐在 石头上 ，手持 那把扇 子，边 唠嗑边 乘凉。 孩子们 却在周 围 跑 跑 跳 跳 ，热得 满头大 汗，不 时听到 “强子 ，别跑 了，快 来我给 你扇扇 ”。孩 子 们 才 不 听 这一套 ，跑个 没完， 直到累 气喘吁 吁，这 才一跑 一踮地 围过了 ，这时 母 亲总是 ，好似 生气的 样子， 边扇边 训，“ 你看热 的，跑 什么？ ”此时 这把蒲 扇， 是 那 么 凉 快 ，那么 的温馨 幸福， 有母亲 的味道 ！ 蒲 扇 是 中 国传 统工艺 品，在 我 国 已 有 三 千年多 年的历 史。取 材于棕 榈树， 制作简 单，方 便携带 ，且蒲 扇的表 面 光 滑 ， 因 而，古 人常会 在上面 作画。 古有棕 扇、葵 扇、蒲 扇、蕉 扇诸名 ，实即 今 日 的 蒲 扇 ，江浙 称之为 芭蕉扇 。六七 十年代 ，人们 最常用 的就是 这种， 似圆非 圆 ， 轻 巧 又 便宜的 蒲扇。 蒲 扇 流 传 至今， 我的记 忆中， 它跨越 了半个 世纪， 也 走 过 了 我 们的半 个人生 的轨迹 ，携带 着特有 的念想 ，一年 年，一 天天， 流向长
实验十外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及检测
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁 移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁 移率即可测出其分于量，这样的标难曲线 只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才 具有可靠性
注意的问题
蛋白质电泳
常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质
非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
6.上样： （1）marker 5µl
（2）细胞样品10 µl + 2×上样buffer 10µl 共 20µl
100℃沸水浴，3-5min ？（蛋白变性）
7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 15µl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可 过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电 流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA （180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
一. 实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 • 2.掌握垂直板电泳的操作方法
•
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺 凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）
• 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰 胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因 素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的 十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁 移率主要取决于蛋白质的分子量大小？
* 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好 浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速 插入梳子,静臵到胶凝
实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
[主要试剂]1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为Ba mHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。
PCR反应体系为：模板（含R基因的重组质粒）1μl上游引物PR11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCR buffer（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O补至100μlPCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pR SETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Ki t或冻融法回收载体大片段。
（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
连接反应体系为：pRSETA1μlR基因片段3μlT4 DNA连接酶（5U/μl）1μl5×buffer2μlddH2O补至10μl3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。
2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。
3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。
6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。
8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42C保温90s,冰浴2。
3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。
4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。
2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。
3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。
7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。
8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。
第一课外源基因在大肠杆菌中的表达原理及微量移液器的使用演示文档
利用大肠杆菌进行外源基因表 达的过程
4. 鉴定目的基因表达产物 ① 抗体鉴定 ② 生物活性鉴定 ③ 序列测定
载体，通过感染或转染进入宿主细胞表达目 的蛋白。 • 优势：能够指导蛋白质的正确折叠，提供复 杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表 达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近于天然的哺乳动物蛋白质分子。 • 缺点：表达效率通常不高。
利用大肠杆菌进行外源基因表 达的过程
1. 构建表达载体 • 在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入
Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA
1931 -
质粒的结构：
1. 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
Werner Arber
Biozentrum der Universität Switzerland 1929 -
Daniel Nathans
Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA
1928 - 1999
Hamilton O. Smith
利用大肠杆菌进行外源基因表 达的过程
1. 构建表达载体（质粒） ① 制备感受态大肠杆菌 ② 将质粒DNA转化感受态大肠杆菌 ③ 提取质粒DNA ④ 质粒DNA定量
利用大肠杆菌进行外源基因表 达的过程
1. 构建表达载体 ⑤ 扩增目的基因 • PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，
外源基因在大肠杆菌中的表达
PL 和 PR 表达系统
转录调控的机理
由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的
阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。
由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。
缺陷 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。 在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃ 提高到 42℃ 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效 果，对重组蛋白表达量有一定的影响。
T7 表达系统
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。
T7 表达系统
T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。
T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
PL 和 PR 表达系统存在的问题
这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L 时抑制，Pi﹤1mmol/L 时激活)，具有较高的转录水平。
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目的基因在大肠杆菌中的诱导表达
一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
[主要试剂]
1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
[操作步骤]
1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
2、构建重组表达载体
（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）
进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
连接反应体系为：
3、获得含重组表达质粒的表达菌种
（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。
4、诱导表达
1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大约需3hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml,，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀，70℃10min。
5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
6 5500rpm 15min 收集细胞
7溶菌酶破碎细胞制备过柱上清8 过柱纯化带组氨酸标签蛋白。