第三章基因表达系统大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统详细表格
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T7表达系统
大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录 体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统 称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合 酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高 活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚 合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合 酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7 噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转 录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动 子控制的基因的转录能达到很高的水平。
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启动子
核糖体结合位点 复制起点
转录终止子
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常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体
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Lac启动子的表达载体
lac启动子：控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因 转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物 后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。
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2>. 转录终止子
启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录 作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的 功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制 另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。
转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提 高蛋白质产物的水平。
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种常用的重组蛋白表达方法，具有以下特点：
1. 简单易用：大肠杆菌是一种常见的细菌，易于培养和操作。
其表达体系基于质粒介导的转化和表达，具有操作简单、成本低廉的优点。
2. 高表达水平：大肠杆菌表达体系能够实现高表达水平，通常可以达到10-50%的总蛋白含量。
这一特点使其成为生物制药和科学研究领域中最受欢迎的表达体系之一。
3. 多种表达宿主：大肠杆菌表达体系有多种表达宿主，包括
BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。
这些表达宿主具有不同的特点，能够适应不同的表达需求。
4. 可定制化：大肠杆菌表达体系可以通过基因工程技术进行改造，实现蛋白质的定制化表达。
例如，可以通过融合表达标签、选择性培养、调控表达等方式来优化表达效果。
5. 可用于生物制药：大肠杆菌表达体系可以用于制备多种蛋白药物，如重组人胰岛素、干扰素、白介素等。
这些蛋白药物已经被广泛应用于临床治疗和研究领域。
总之，大肠杆菌表达体系是一种快速、高效、可定制化的表达系统，已经成为蛋白质表达和生物制药领域中最常用的表达系统之一。
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大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
真核基因在大肠杆菌中表达
增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源 基因的表达效率。
翻译终止子：必须存在终止密码子。
✓ 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。
✓ 大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA ✓ 当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。
真核基因在大肠杆菌中表达
翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。
未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降 低mRNA 5’-末端二级结构的形成，增加RBS中A、 T含量，碱基定点突变等。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物 和哺乳动物细胞等
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机 理研究的比较深入。
➢ 安全(被FDA批准为安全的基因工程受体生物)， 且有多种不同的菌株和质粒载体。
➢ 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 ➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进
物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。
真核基因在大肠杆菌中表达
转录终止子（TT）
✓ 上游启动子会抑制下游启动子 的转录功能(启动子封堵作用)， 因此需要在克隆基因编码区的 3’-末端接上一个有效的转录终 止子。
✓ 转录终止子能增强mRNA分子 的稳定性，从而提高蛋白质产 物的水平。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因在大肠杆菌中表达
内容提纲
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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基因工程3大肠杆菌表达系统
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法， 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基 发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
5、容易进行代谢调控；
6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：
1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、
链霉菌等；
2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物
细胞等。
一、真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系 统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆 虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大 肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
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TAAGGAGG（N）8
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
• • • • • 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
转录水平
翻译水平
（1）启动子
要使克隆的外源基因高水平表达的最佳 启动子，必须具备以下几个条件： 1）必须是一个强启动子。 2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达 水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为 重要的条件。 3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的 方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理 （如热）和化学（如IPTG）诱导 。
（5）翻译终止密码
对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条 件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆 菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码 子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。
大肠杆菌表达系统
T7 表达系统
转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因
两个质粒的复制子和抗性标记 不能相同
调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型
ColE1 ori
AmpR
T7 启动子
目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
lac、tac 启动子对宿主菌的要求
为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一
种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统。
大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac 表达系统的宿主菌。
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被 FDA批准为安全的基因工程受体生物
外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
裂解循环还是溶源循环。
PL 和 PR 表达系统
转录调控的机理
由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的
阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。
缺陷 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。 在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃ 提高到 42℃ 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效 果，对重组蛋白表达量有一定的影响。
大肠杆菌表达
大肠杆菌表达引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。
大肠杆菌表达系统具有高效、经济且易于操作的特点，因此被广泛用于重组蛋白的生产。
本文将介绍大肠杆菌表达系统的基本原理及其在蛋白质表达中的应用。
大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统采用重组DNA技术，将外源基因插入到大肠杆菌的表达载体中。
表达载体通常包含一个启动子、一个转录终止子、一个选择性抗生素抗性基因和一个参考基因。
启动子能够促使外源基因的转录，转录终止子能够终止转录过程，选择性抗生素抗性基因则能够确保只有带有外源基因的细菌存活下来。
参考基因用于对比表达水平，以评估外源基因的表达效果。
大肠杆菌表达系统的步骤大肠杆菌表达系统的基本步骤如下：1.选择适当的表达载体：根据需要选择合适的表达载体，包括质粒和噬菌体。
2.插入目标基因：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶法完成插入。
3.转化大肠杆菌：将重组载体导入大肠杆菌细胞中，通常使用热激转化或电转化的方法。
4.选择性培养：将转化后的菌液接种到选择性培养基上，以筛选含有外源基因的细菌。
5.表达蛋白质：使用适当的培养条件和诱导方法，促使含有外源基因的细菌表达目标蛋白质。
6.蛋白质纯化：利用亲和层析、离子交换层析等技术，对目标蛋白质进行纯化。
大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达系统在蛋白质表达领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.重组蛋白质的生产：大肠杆菌表达系统可用于大规模生产重组蛋白质，如重组人胰岛素等。
2.蛋白质结构和功能研究：通过大肠杆菌表达系统，可以表达和纯化具有特定结构和功能的蛋白质，用于研究其结构和功能。
3.抗原制备：大肠杆菌表达系统可以用于表达和纯化目标蛋白质，作为疫苗的抗原。
4.酶的生产：利用大肠杆菌表达系统表达酶，可以实现酶的大规模生产，用于工业生产和生物催化等领域。
总结大肠杆菌表达系统是一种高效、经济且易于操作的蛋白质表达系统。
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蛋白质糖基化
• 蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译 后修饰方式 ；
• 糖基化影响蛋白折叠、定位、转运、生物活性、 可溶性、抗原性、半衰期。
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• 1、N-linked glycosylation • a sugar attach to the amino group of an asparagine （天冬氨 酰）. • sequence motif AsnXaa-Ser/Thr
Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine（N-二 羟乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 ) Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35 Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低 生长慢
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histidinol dehydrogenase gene (his4)
宿主His4突变，不能合成组氨酸， 在His缺陷培养基上不能生长； 质粒上有His4, 可合成组氨酸， 用His缺陷平板筛选转化菌株。
KM
AOX
质粒线性化后转化宿主细胞
线性化位点
线性化质粒发生同源 重组的几率提高
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pAO815和pPIC9K 在Sal I 、Stu I 单切, 在his 4插入（单交换）， 不破坏宿主的AOX1，转 化GS115后产生： His +/Mut+ 单交换
同源重组基因转移法 ：是将外源基因定位导人受体细胞染色体 上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一 或双交换，新基因片段可替换原有基因片段。
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Байду номын сангаас
2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR
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胞内表达载体, pAO815
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胞外表达载体,
pIC9K
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pPIC9k, 胞外表达载体
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3. 多拷贝产生，pIC9K, 体内形成多拷贝
因为未线性化的环状质粒之间发生同源 重组的几率非常低
未线性化的环状质粒发生同源 重组的几率非常低
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2、O-linked glycosylation, In O-glycosylation, a sugar is attached to the hydroxyl group of a serine or threonine residue.
• no sequence motif defined
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保持感受态细胞在冰冻状态作转化！
• Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice. • It is critical to add DNA to frozen cell samples.
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载 体, 可在大肠杆菌中 操作
转化宿主细胞
组氨酸缺陷平板 筛选重组子
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G418 筛选pIC9K 多拷贝
pAO815和pPIC9K
PCR检测 转化细胞中的基因插入
诱导表达 SDS-PAGE检测
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酵母菌转化
PEG 1000 Transformation Method for Pichia
酵母表达系统
优点
1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化
2 操作容易
3 经济 4 快速
1
酵母细胞结构
2
两种酵母表达系统
酿酒酵母表达系统 Saccharomyces cerevisiae 过去常用
毕赤酵母 Pichia pastoris 现在多用
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Pichia pastoris 表达系统
• Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯
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BMGY： Buffered Glycerol-complex Medium
BMMY： Buffered Methanol-complex Medium (1 liter) 成分：1% yeast extract 2% peptone 100 mM potassium phosphate, pH 6.0 1.34% YNB 4 x 10-5% biotin 1% glycerol （ BMGY ）or 0.5% methanol （ BMMY）
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• 3、C-Mannosylation （甘露糖化） • sugar is linked to the protein through a carboncarbon bond.
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• 4、 GPI anchor attachments. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins. 糖基磷脂酰肌醇锚 • binding to the plasma membrane
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毕赤酵母系统的注意事项 1. 2. 3. 4. 5. 严格无菌操作，防止污染；可以镜检 温度≤30C; 转化 PCR检测 诱导时间
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酵母蛋白糖基化
• 酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露 糖型； • 然而毕赤酵母中蛋白翻译后所增加的寡糖链长度 （平均每个支链8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中 的（50-150 个甘露糖残基）短得多，但比人的大； • 酿酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖连接头，而毕赤 酵母则没有。一般认为α-1,3聚糖接头与蛋白的超抗 原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。
Filter sterilize and store at -20°C.
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制备感受态细胞
1. 划线接种酵母菌，YPD平板， 30°C for two days. 2. 挑菌落于 10 ml YPD 30°C 摇过夜. 3. 转培养到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，室 温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭菌 的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀，液 氮快速冷冻， -70°C保存。
• To perform multiple transformations, it is recommended to process them in groups of six at a time.
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Transformation
• 1. 10-50 μg DNA（20 μl液体中）， 直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA）； 2. 37°C 水浴5分钟， 中间混匀两次； 3. 加 1.5 ml of Buffer B ， 彻底混匀； 4. 30°C水浴1 hour； 5. 2000 x g 离心10 ， RT， 去上清，细胞悬浮在 1.5 ml Buffer C 中； 6. 离心后将细胞悬浮在 0.2 ml Buffer C中； 7. 将细胞涂布在选择培养平板（MD）上， 30°C for 3 to 4 days.
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pAO815
可体外构建多拷贝
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BamH I：GGATCC CCTAGG
Bgl II：AGATCT TCTAGA
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4. 宿主细胞 Pichia Strain 基因型
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变 可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长 在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长
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毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：
1.蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。 2. 操作时与E. coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒 或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、 简单、廉价，且表达水平更高。 3.同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗 传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十 倍以至百倍。 这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
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pAO815和pPIC9K 在 Bgl II Bgl II双切：
在5AOX1位点和 3AOX1双交换，替 换掉了宿主的AOX1 基因， 转化后GS115产生 His +/Muts
5 AOX1
His4
3AOX1
gene
AOX1
His4
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技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
pAO815 体外构建多拷贝 线性化质粒
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YPD培养基
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 liter)
1% yeast extract 2% peptone 900 ml of water Autoclave for 20 minutes on liquid cycle. 2% dextrose (glucose)， （20%储存液，抽滤灭菌）。
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