第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
如何构建一个高效表达真核生物基因的大肠杆菌的表达体系
如何构建一个高效表达真核生物基因的大肠杆菌的表达体系华中师范大学生命科学学院生物科学2011211870 李书婷概要：构建一个高效的表达体系,包括了对宿主菌的选择及相应载体的构建。
基因工程技术的核心是基因表达技术。
影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。
大肠杆菌作为宿主菌的特点1，原核生物单细胞异样，生长快，代谢易于控制。
能快速获得大量基因代谢表达代谢产物。
2，基因结构简单，便于基因操作和基因分析。
3，原核生物内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的载体。
4，生理代谢途径及基因表达机制比较清楚。
关键词：表达载体启动子终止子核糖体结合位点翻译密码子质粒拷贝数一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。
2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。
3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。
5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。
6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。
二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。
启动子是在转录水平上影响基因表达。
转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。
也就是说启动子会有强弱之分。
要获得高校表达必须选择强启动子。
由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。
通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λP L等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。
生物工程概论期末考试题
发酵工程复习题一、选择题：1.厂用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸，结果代谢产物没有谷氨酸而产生乙酰谷氨酰胺，其原因是（）A．温度控制不适 B．通气量过多 C. pH呈酸性 D.溶氧不足2.青霉素生产的叙述,正确的是（ B）B．用紫外线、激光、化学诱变剂处理青霉菌再经筛选的方法可以选育高产菌种3.有关谷氨酸棒状杆菌的生长和谷氨酸发酵的叙述．错误的是（ B）B．菌体能合成各种生长因子，不需要从外界补充4.属于生长因子的是（ D ）D 维生素5.菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而会抑制微生物的生长，原因是（A ）A．碳源供应太充足6.作为生产菌种和科研材料的细菌群体，应该是代谢旺盛、个体形态和生理特性比较稳定的。
所以应选择在它的（B ）B 对数期7.与调整期缩短有关的因素中，最全面的一组是(C )①用与菌种相同的培养基②营养丰富的培养基③稳定期获得的菌种④对数期获得的菌种⑤接种时间提前⑥接种量加大⑦接种量减少⑧接种种类增多C．①④⑥8.谷氨酸发酵过程中，如果环境条件控制不当，则可能使代谢产物成为乳酸，那么乳酸是下列哪种条件下的产物（ D ）D．溶氧不足9. 能影响发酵过程中温度变化的因素是（ D）A．微生物分解有机物释放的能量B．机械搅拌C．发酵罐散热及水分蒸发D．A、B、C都对10.应用发酵工程生产的产品不包括（ D）D．目的基因二、名词解释：1.发酵工程(fermentation engineering):研究发酵工业生产过程中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学。
发酵工程具体包括菌种选育、菌体生产、代谢产物的发酵以及微生物机能的利用等2.培养基 : 原料其化学成分明确、稳定适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产3.培养基: 80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。
4.生理性酸性物质；生理性碱性物质经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的营养物叫生理酸性物质，若菌体代谢后能产生碱性物质的营养物称为生理碱性物质5.连续培养指在向反应器中添加培养基的同时，从容器中放出等体积的培养液，就可以形成一个生产细胞的连续过程，即在培养器中所形成的新细胞数量与从容器中流失的细胞数目相等，反应体系达到稳态；菌的积累速率=生长速率-流出速率,6.抗生素：是生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞的有机物。
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。
（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。
②有各类菌株和载体系列。
③目前以实现多种基因的高效表达。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
④易培养，成本低。
缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功表达。
三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
基因工程课后习题答案
2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。
穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。
探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。
通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。
cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。
5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。
8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
第4章 基因在大肠杆菌和酵母中的表达
降低包含体形成的措施： 降低培养温度；诱导物浓度； 培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。
包含体复性方法： 尿素； 透析、稀释和超滤复性法； PEG、TritonX、肝素、人工伴侣等
原核表达系统的优点与不足
优点：
产量高、表达高效； 操作简单（可调控表达、方便纯化）； 可大规模发酵生产； 成本低。
不足：
缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。 表达产物易形成包含体。
第二节 真核表达——目的 基因在酵母中的表达
酵母菌表达外源蛋白的优点：
遗传背景清楚 属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加 工系统 可发酵生产 不产生内毒素，属安全的表达系统
2
ü 优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标
蛋白质的纯化就比较简单
2. 蛋白质酶解的程度不甚严重
3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用 （氧化环境）
4. 蛋白质的N-末端结构真实
正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在 体内对信号肽进行切割
五、包含体及复性
包含体（inclusion body）：蛋白质在大肠杆菌中 大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物 活性的固体颗粒。
T7 RNA聚合酶/T7启动子的优点：
合成RNA的速度高；
只识别T7启动子，不启动其它基因的转录；
对利福平（能抑制大肠杆菌RNA聚合酶）等抗 生素有抗性，能表达一些大肠杆菌RNA聚合酶 不能转录的序列；
产物量大，可达总蛋白的25％以上。
1
94kDa 67 kDa 43 kDa
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
基因在大肠杆菌和酵母的高效表达
MCS
T7启动子 lacZ pET28a 结构
三、 蛋白质的融合表达
蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的 编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行
表达。
在这种融合蛋白结构中，通常载体的担体蛋白部分位于
N端，目的蛋白位于C端。
通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性
载体与受体系统
载体：pET表达系统（pET15，pET16，pET28，pET30，pET42 等a/b/c三套，及pRSET）
大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基 因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG （异丙基硫代β－D－半乳糖苷）可诱导T7RNA聚合酶大量合 成。
4.3 基因在酵母中的高效表达 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达
第一节 基因的表达系统与表达策略
基因的表达系统 基因的高效表达策略
一、基因的表达系统
表达载体的组成：
DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 性基因 及Amp, Tet抗
融合型目的蛋白表达系统的构建
用于融合蛋白构建的担体蛋白： 谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 免疫亲和层析 pRIT2T
金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）
硫氧化还原蛋白（TrxA）
b-半乳糖苷酶（LacZ） 泛素蛋白（Ubi）
本章目录
4.1 基因的表达系统与表达策略 4.1.1 基因的表达系统 4.1.2 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略 4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达 4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 4.2.2 蛋白质的融合表达 4.2.3 蛋白质的分泌型表达 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性
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第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。
（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。
②有各类菌株和载体系列。
③目前以实现多种基因的高效表达。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
④易培养，成本低。
缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功表达。
三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
原核体系中表达真核基因的困难1.细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；2.真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；3.真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；4.表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。
四、构建表达载体的策略⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。
⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。
⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。
第二节基因在大肠杆菌中的高效表达一、大肠杆菌表达载体的成份⑴启动子要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。
⑵转录终止子使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。
尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。
⑶核糖体结合位点在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）(4)筛选标记基因(5)密码子的选择二、常见的大肠杆菌表达系统①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。
②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG 诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。
③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。
④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。
三、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录起始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。
1.启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TATAAT)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成，5’-- TTGACA故称为-35区，)。
当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。
另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。
所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno 首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。
一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S 核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。
3.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。
另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。
四、蛋白质的融合表达融合表达一般是将基因引入某表达载体编码的高表达蛋白（担体蛋白）序列的3’末端。
表达出来的融合蛋白的N末端含有由担体序列编码的片段。
融合蛋白可以直接用作抗体，但通常是将N端的担体蛋白部分从C端的目的蛋白中裂解出来，有利于对目的蛋白进行生化研究及功能分析。
方法主要有：化学裂解法和酶解法。
五、蛋白质的分泌型表达将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。
●实现蛋白质分泌表达有许多有利之处：1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。
生产的蛋白质和天然蛋白质是一致的。
2.周质中蛋白酶活性低，分泌的蛋白稳定。
3.周质中细菌的蛋白很少，使得重组蛋白易纯化。
4.周质中提供了一个氧化环境，更有利于二硫键的正确形成。
因此，对于许多难以纯化的蛋白质可以通过分泌表达来实现生产。
六、蛋白质的包含体形式表达●重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。
●包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。
●不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。
●重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。
●包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。
●不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。
减少包含体形成的策略：1.降低重组菌的生长温度。
2.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。
如高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖。
3.供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH值等。
不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白的破坏。
有效、理想的复性方法应具备一下几个特点：1.活性蛋白质的回收率高。
2.正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。
3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。
4.折叠复性方法利用放大。
5.复性过程耗时较少。
第三节基因在酵母中的表达一、大肠杆菌表达系统的缺陷1.缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等。
2.表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和生物活性。
因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。
如酿酒酵母、甲醇酵母等。
二、甲醇酵母表达系统●甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源。
●甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛，乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱，因此甲醇酵母代偿性的大量产生这种酶。
●调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异源蛋白的表达。
（一）甲醇酵母表达系统的优点1.具有强启动子，可严格调控目的蛋白的表达。
2.可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。
3.营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产。
4.可高密度发酵培养。
（二）影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素1.目的基因的特性2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数3.宿主的甲醇利用表型4.分泌信号5.产物稳定性6.翻译后修饰。