外源基因在酵母体系中表达
酵母表达(1)
酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
甲醇酵母系统表达的影响因素
酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。
了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。
如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。
解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。
目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。
外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。
外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。
2、表达框的染色体整合位点和方式虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。
整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。
AOX1和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase，HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。
Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。
这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。
因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。
3、宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。
aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。
酵母整合型表达载体整合原理和整合原件
酵母整合型表达载体整合原理和整合原件一、概述酵母整合型表达载体是一种用于基因工程研究中的重要工具，它能够整合外源基因并稳定地在酵母细胞中表达。
这一载体在生物技术领域具有广泛的应用，能够帮助科研人员进行基因表达调控、蛋白质功能研究等方面的工作。
本文将针对酵母整合型表达载体的整合原理和整合原件进行深入探讨，并结合个人观点对其进行分析。
二、整合原理酵母整合型表达载体的整合原理是指外源基因在酵母细胞染色体中的整合方式和机制。
一般来说，酵母整合型表达载体通过与酵母染色体的同源配对，使外源基因在染色体特定位点发生整合。
整合的过程需要依赖一系列的整合原件来进行调控和介导。
其中，整合原件主要包括酵母选择标记基因和整合酶等。
1. 酵母选择标记基因酵母选择标记基因是酵母整合型表达载体中的重要组成部分，它能够在酵母细胞中产生特定的表型，并在培养基中通过筛选来实现对整合事件的筛选。
常见的酵母选择标记基因包括TRP1、LEU2、HIS3等，它们分别对应酵母细胞的色氨酸、亮氨酸和组氨酸代谢通路，能够使突变体在对应的缺陷培养基上无法生长。
通过选择适当的酵母选择标记基因，可以在整合过程中实现对突变体的筛选，从而保证整合事件的稳定性和准确性。
2. 整合酶整合酶是酵母整合型表达载体中的另一个重要组成部分，它能够介导整合事件的进行，并在酵母细胞中调控外源基因的整合。
常见的整合酶包括酵母整合酶(INC)和整合介导蛋白(INP)等，它们能够与酵母染色体上的同源序列进行特异性结合，并介导外源基因的整合过程。
通过对整合酶的调控和改变，能够实现对整合事件的精准和高效地控制，从而满足不同研究需求的整合要求。
三、个人观点酵母整合型表达载体的整合原理和整合原件在基因工程研究中发挥着重要的作用，它们为科研人员提供了强大的工具和评台，能够帮助他们实现对外源基因的整合和驱动。
在未来的研究中，我认为可以进一步优化和改进整合原件的设计和构建，以提高整合事件的稳定性和效率，从而更好地满足不同研究领域对整合事件的需求。
酵母表达系统
酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。
其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。
1、酵母表达系统的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。
酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。
某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。
解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。
因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。
甲醇诱导酵母表达的原理
甲醇诱导酵母表达是一种基因工程技术，它的原理是利用受体与配体相结合的原理，通过添加甲醇到培养基中，从而诱导酵母表达特定的外源基因。
这里的“受体”是一种称为Mxr1的转录因子，它不含甲醇时处于非活性状态，加入甲醇后与其配体Met4结合形成活性形式。
而Met4是Mxr1的配体，等待激活Mxr1转录因子的信号来自于甲醇的代谢产物-甲醛。
当酵母中有外源基因需要表达时，可以将该基因与Mxr1和Met4组成的启动子串联起来，在培养基中添加甲醇后，促使Mxr1与Met4相结合，使得启动子被活化，从而使外源基因得以表达。
基于此原理，甲醇诱导酵母表达技术可以实现高效和可控的外源基因表达。
甲醇的使用量可以在一定范围内调节外源基因表达水平，使得表达能够满足研究或应用的需求。
该技术不仅应用于科学研究，如蛋白质的产生与纯化等，还在药物和生物燃料等领域有广泛应用。
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因
酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因酵母菌表面展示是一种常用的蛋白质工程技术，通过将外源基因转入酵母菌表面展示系统，实现目标蛋白质在酵母菌表面的展示和筛选。
下面将介绍酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因的具体步骤。
1. 提取外源基因：首先，需要从源细胞中提取所需的外源基因。
外源基因可以通过PCR扩增、酶切或合成等方法得到。
确保提取到的基因具有正确的序列，并进行验证。
2. 构建表达载体：将提取到的外源基因与适当的表达载体连接。
表达载体通常包括启动子、终止子、选择标记和酵母菌表面展示相关的信号序列。
确保外源基因与表达载体正确连接，并进行验证。
3. 转化酵母菌：选取适合的酵母菌株，并将构建好的表达载体转化到酵母菌中。
转化方法可以根据实验需求选择化学法、电转法或基因枪等。
转化成功后，利用适当的培养基对转化后的酵母菌进行筛选和生长。
4. 筛选积极克隆：将转化后的酵母菌接种到含有选择标记的培养基中，进行筛选。
通过筛选，可以获得表达载体成功转入外源基因的积极克隆。
此步骤通常需要一定时间，取决于所选择的培养基和酵母菌株的特性。
5. 鉴定表达：对筛选出的积极克隆进行表达检测。
可以利用Western blotting等方法，检测目标蛋白是否在酵母菌表面成功展示。
确保所筛选出的克隆具有预期的表达效果。
6. 进一步应用：对表达成功的酵母菌克隆进行进一步的应用。
可以利用这些酵母菌克隆进行蛋白质相互作用研究、酶活性检测、抗原表位筛选等。
根据实际需求进行相应的实验设计和操作步骤。
以上是酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因的基本流程。
在实验过程中，需要注意优化实验条件，保证实验的重复性和可靠性。
同时，根据实验需求调整各个步骤的细节，以获得最佳的实验结果。
转化酵母实验报告
一、实验目的1. 掌握酵母转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉酵母转化过程中所使用的试剂和仪器。
3. 通过实验，了解酵母转化实验在基因工程中的应用。
二、实验原理酵母转化是指将外源DNA分子导入酵母细胞内，使其在酵母细胞内表达的过程。
本实验采用化学转化法，利用氯化钙处理酵母细胞，使其成为感受态细胞，从而实现外源DNA的导入。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 酵母菌株：Saccharomyces cerevisiae- 载体质粒：pUC19- 酵母转化试剂盒：S.C. EasyComp Transformation Kit- YPD培养基：酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖- 氯化钙：CaCl2- 甘油：丙三醇- 碘化钾：KI- 磷酸氢二钠：Na2HPO4- 磷酸二氢钠：NaH2PO4- 水合氯醛：CHCl3- 无水乙醇：C2H5OH- 70%乙醇：C2H5OH2. 实验试剂：- 20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶于80ml蒸馏水中- 10mg/mL质粒DNA溶液：取适量质粒DNA，加入适量无菌水，配制成10mg/mL 的溶液- Solution I：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），含1.0mol/L氯化钠- Solution II：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），含1.0mol/L氯化钠和1.0mol/L甘露醇四、实验步骤1. 酵母细胞培养- 将酵母菌株接种于YPD培养基中，于30℃培养过夜。
- 次日，挑取单菌落，接种于50mlYPD培养基中，于30℃、220rpm摇床培养过夜。
2. 酵母细胞感受态制备- 取适量菌液，于4500rpm、室温离心5min，弃上清。
- 加入10ml Solution I，重悬菌体。
- 4500rpm、室温离心5min，弃上清。
- 加入1ml Solution II，重悬菌体。
- 将菌液分装至1.5ml离心管中，每管50μl，于-80℃保存。
3. 酵母转化- 取适量质粒DNA溶液，加入适量无菌水，配制成10ng/μl的溶液。
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C.albicans hyphal n.r cell wall Ag
Spinach
2
phosphoribulokinase
S/Mut+ Halaas, et al (1995)
Shiba, et al (1995)
S/Mut+
S/Mut+, S/MutS( 30,000 copies/c ell) S/MutS
fragment C
Pertusis
3
antigen P69
Mouse EGF 0.45
Aprotinin 0.8
Kunitz
1
protease
inhibitor (A-
beta-PP)
Human
4
serum
albumin(HS
A)
HIV-1
1.25
gp120
and
0.02
I/Mut+ and Muts I/Muts S/Muts S/Mut+/Muts S/Mut+
第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。
第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：
1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。
S:284
ds Fv (di-sulfide-bonded n.r S/n.r Luo, et al (1995), J.
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在基因工程表达调控水平上，巴斯德毕 赤酵母（Pichia pastoris）基因表达系统 已有许多新进展。
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Kunitz protease inhibitor 1 S/Mut+ (APLP-2)
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短短十多年来，用该系统表达的外源基 因已达三百多种，表达的产物包括细胞 因子、基因工程疫苗、基因工程抗体、 蛋白酶及受体等，表1为利用毕赤酵母表 达的活性蛋白，其中大部分可成为医药 制品，用发酵罐发酵规模可达20-50M3以 上。因此，毕赤酵母表达系统的研究进 展具有极重要的经济效益和社会意义。
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TAP(tick anticoagulant 1.7
protein)
Porcine
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lipoxygenase (72kD)
目前用于基因表达的酵母表达 系统主要类型有以下11种：
酿酒酵母表达系统 粟酒裂殖酵母表达系统 克鲁维酵母表达系统 毕赤酵母表达系统 汉逊酵母表达系统 解脂耶鲁酵母表达系统
假丝酵母表达系统 许旺酵母表达系统 嗜腺嘌呤阿祖鲁酵母表达系统 丝孢酵母表达系统 球拟酵母表达系统
酵母菌基因工程载体：
载体类型的发展：毕赤酵母载体一般为穿 梭载体(Shutt1e Vector)，通常具有甲醇精确 诱导调控的醇氧化酶(Alcohol Oxidase ,AOX) 启动子PAOX；根据酵母菌基因组上 AOX结 构基因被外源基因所替换情况，形成Mut+ 或Mut-等不同表型；载体含有一个多克隆位 点、AOX1转录终止序列、酵母选择标志 His4以及来自大肠杆菌质粒 pBR322的Amp 和ColE ori序列等。
酵母附加体型载体(YEp) 酵母复制型载体(YRp) 酵母着丝粒型载体(YCp) 酵母线性载体(YLp) 酵母整合载体(YIp) 酵母人工染色体(YAC)
酵母复制起点：2μori ; ARS 酵母来源 DNA 酵母调控元件：AOX1; GAP
酵母选择标记：Trp1; Leu2; Ura3; His4 酵母载体
S/Mut+ and Muts
I and S/Mut+
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外源基因在酵母体系中的表达
外源基因在酵母体系中的表达
酵母菌是一种单细胞真核生物，人们对其 遗传学、生理学和全基因组序列等方面已有 较为深入的研究。酵母菌在分类学上属于真 菌界子囊菌纲和担子菌纲，目前已发现90多 个属，700多个种，10000多个独立菌株，构 成一个庞大的微生物家族。
酵母作为基因工程表达系统，既有原核生物 那样生长、繁殖快速，表达量高的特点，又 有与高等真核生物十分相像的蛋白质翻译后 加工和基因表达调控的特征。另一方面，长 期以来酵母作为工业微生物的主要菌种，在 工业化发酵方面已积累了大量的经验。因此 酵母表达系统是一种有着非常大的发展潜力 的真核生物基因表达系统。
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5
Angiotensin-conventing n.r
enzyme(90kD,active)
galactosidase total protein)
Invertase
2.3
Tumor
10
nectosis
factor(TNF)
Bovine
0.55
lysozyme c2
Streptokinase 0.08
(active)
Where/how expressed* I/Muts
I/Mut+ S/Mut+ I/Muts
Rabbit
scFv >0.1g/L
(30kD)
CP15(Cryptospori n.r
dium parvum)
Rat pit-1
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