水貂阿留申病毒荧光PCR检测方法的实验室规范
水貂阿留申病毒纳米PCR检测方法的建立与初步应用
期 11
杨 瑞 梅 等 ：水 貂 阿 留 申 病 毒 纳 米 PCR 检 测 方 法 的 建 立 与s.ThelowerdetectionlimitofthenanoPCRassaywasabout4.0×102copies.Furthermore，atotal of40clinicalsamplesweredetectedbythisassay.TheresultsshowedthatthenanoPCRissensitivethan counterimmunoelectrophoresis （CIEP）.ThenanoPCRassaydevelopedinthisstudycanbeapplied widelyinclinicaldiagnosistheurineandfecesandfieldsurveillanceofAMDV-infection. Keywords：Aleutian minkdiseasevirus；nanoparticlePCR；molecularassay
畜牧兽医学报 2016，47（11）：2288-2293
ActaVeterinariaetZootechnicaSinica
doi：10.11843/j.issn.0366-6964.2016.11.017
水貂阿留的申建病立毒与纳初米步PC应R用检测方法
杨瑞梅，张传美，张洪亮，单 虎*
（青岛农业大学动物科技学院，山东省预防兽医重点实验室，青岛 266109）
TheEstablishmentandApplicationofNanoparticlePCR Molecular AssayforDetectionofAleutian MinkDiseaseVirus
YANGRui-mei，ZHANGChuan-mei，ZHANG Hong-liang，SHAN Hu* （KeyLaboratoryofPreventiveVeterinary MedicineofShandongProvince，CollegeofAnimal
水貂阿留申病的检疫方法
150069 D O I:10援3969/J.IS S N 援1671-6027援2018援11.117
水
貂 奏黑
龙
阿 江
省 哈
尔 滨 市
留
野
申 生
动
病 物
研 究
黄 海
的 所
踪
娇
黑
龙
检 江
哈
疫 尔
滨
方 法 揍
壁变厚尧 内径变小袁 外周有淋巴细
胞要 要要浆细胞大量聚集袁 发生结节性
动脉炎遥
2 实验室进行血清学检测袁常用的方法如下:
患阿留申病水貂血清中丙种球蛋白
含量增多袁当与碘液相混合时出现凝集反应袁而健康水貂血
清中丙种球蛋白含量少袁 与碘液相混合则不出现凝集反应遥
碘凝集反应不是一种特异性反应袁其缺点是检出率不高和出
现假阳性反应袁但其优点是简便易行尧经济遥
为袁先不要过早干预袁急于取出幼崽袁仍先以观察为主遥 一段 时间后袁如果母兽还是将幼崽弃之在草丛中不理袁则由饲养 人员取出由人工抚育遥 注意在取幼崽过程袁不可惊扰母兽袁以 免影响其养育别的幼崽袁进一步造成其他幼崽被弃养遥
参考文献
畜牧兽医科技信息
表面有灰白色斑点状病灶袁 切面可见 质地脆弱遥 病程长的病例袁其色变浅袁 不肿大遥 牌急性期肿大明显袁 呈深红 色遥 慢性病例可萎缩袁边缘变薄袁呈红 褐色袁切面白髓明显遥 淋巴结肿大遥 胸 腺萎缩袁呈黄褐色袁质软袁表面有粟粒 大的出血点遥 渊 2冤 病理组织学变化 最具特征性的病理组织学变化是浆细 胞显著增多袁呈浸润状态遥 开始较少的 浆细胞增生发生在淋巴结尧骨髓尧肝尧 牌尧肾等器官袁随着病情的发展袁多量 的浆细胞浸润可发生在各器官组织袁 血管周围可形成管套状浸润遥 淋巴结尧 脾尧 胸腺及骨髓等免疫器官可发生实 质性细胞受损袁T 淋巴细胞进行性减 少袁B 淋巴细胞及浆细胞增多尧 浸润遥 肾脏肾小球性肾炎袁间质性肾炎袁肾小 管变性袁浆细胞浸润遥 睾丸生精细胞退 行性病变袁部分病例附睾损伤遥 卵巢内 膜细胞受损袁难以形成成熟卵细胞遥 脑 膜炎和脉络丛炎及神经细胞变性遥 肝 脏胆管增生袁动脉壁纤维素变性袁血管
水貂阿留申病毒检测方法研究进展
水貂阿留申病毒检测方法研究进展刘艺;刘亚东;杜锐;冷雪;时坤;李健明;曾范利;宗颖;宫庆龙;张姗姗;孙志博【摘要】水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的以浆细胞增多为主要特征的慢性、消耗性、病毒性传染病.主要侵害水貂的免疫系统,导致机体免疫系统紊乱引起的器官衰竭,病死率极高,严重损害了水貂养殖产业的经济利益,该病存在于绝大多数养殖水貂的国家和地区.目前,能有效预防该病的疫苗尚未研制成型,该病的防控已成为水貂养殖领域的世界性难题,在防控方面主要采取淘汰检疫阳性水貂的办法.论文主要针对目前该病在国内外检测方法的特点和流行情况进行阐述,以期为水貂阿留申病快速检测方法的建立及水貂阿留申病的有效防控提供参考.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2018(039)010【总页数】4页(P74-77)【关键词】阿留申病毒;检测方法;防控【作者】刘艺;刘亚东;杜锐;冷雪;时坤;李健明;曾范利;宗颖;宫庆龙;张姗姗;孙志博【作者单位】吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118;吉林农业大学,吉林长春 130118【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,ADM)是一种能够令宿主终生携带并引起机体免疫系统紊乱的毒血症。
水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus，ADV)感染幼貂，可在其肺泡Ⅱ型细胞高效复制，引起急性致死性间质性肺炎，而感染成年貂，则主要感染淋巴结巨噬细胞，呈低水平病毒复制，引起以脾肿大、高丙种球蛋白血症、浆细胞增多、动脉炎、免疫复合物型肾小球肾炎为特征的慢性疾病，可致使水貂消瘦，繁殖力低下[1-2]。
一批进境种用水貂阿留申病的检验检疫
的输 出 国家 的官 方检疫 证 书 等相关 ３１３ Ｐ ．～ ． 三 羟 甲 基 氨 基 桥 ．核对 电极 与样 品孔 间 的正 确连 ．． Ｈ８ ８６的 ５ 现场 临床 检疫 ．检查 全群水 貂 的精 巴 比妥 钠 １ Ｉ１ ， 羟 甲基 氨 基 甲 压 至 ９ ～ ０ ０３ 三 ｇ ０ １０伏 ｆ 不得 大 于 １０伏 。 ０ 神状 态 、 毛 、 立及 俯 卧 姿 势 、 被 站 天 烷 （ ｒ ）． ５ｇ 叠 氮 钠 ０２ｇ 各 加 否则 易使 凝胶 板干 裂而 影 响沉淀 线 Ｔｉ ６０ ， ｓ ０ ． ， 然孔 、 排泄 物等 认定 。 入适量 二 级水溶 解后 ． 盐酸 将 Ｐ 观 察１ 电泳 ３ ～ ０ｍｉ。 闭 电源 。 用 Ｈ 。 ０６ ｎ关 以黑 色 为背景 ． 观察 沉 淀线 ． 定反 判 称 取 应 结 果 阳性 ：在抗原 和 血清 孔间 稍偏 曲 的十分 清 晰的灰 白色沉 淀线 且 阳
２１ 进 入 指 定 隔 离 场 的 水 貂 采 取 馏 水 中 ．水 浴 煮 沸 溶 化 。再 加 入 ． 单 只独笼 饲养 ． 并逐 只编 号 。
２２ 隔 离 场 兽 医 每 天 对 水 貂 进 行 注板 。 ．
临床 ．
性对 照成 立者 。 即判 阳性 （ ） ＋ 。若 在 ｌ － 结 果 ：此 批 水 貂 检 疫 证 书 有 值调 至 ８５ ８６ 最后 用 二级 水 定 容 取 出琼脂 板 在 侧 强 光 或 日光 灯 下 。 ３ ．～ ．．
效． 临床检 疫无 异常 ． 将水 貂转 运 至 至 １Ｏ ０ｍｌ ０ 。
田国宁 张 金玲 孙 军 韩 亮 张丽萍 （ 山东省潍 坊 出入 境检 验检 疫局 ２ １４ ） ６ ０ １
２０ ０ ５年 １ ０月 中旬 潍 坊 某公 司 将 水貂趾 尖 剪掉一 段 后用 玻璃 毛 细 界面 掰断 毛细 管 ．用移 液器 吸 头将
水貂阿留申病的诊治
水貂阿留申病主要在北美、欧洲 和亚洲等地流行，多呈地方性流 行或散发。该病多发于密集饲养 的水貂场，尤其是幼貂养殖场。
易感动物与发病季节
易感动物
水貂是阿留申病毒的主要宿主和传染 源，其他动物如狐狸、狼等也可能感 染该病毒，但通常不发病。
发病季节
水貂阿留申病一年四季均可发生，但 通常在秋冬季节发病率较高。
合理搭配饲料
根据水貂不同生长阶段的营养需求， 合理搭配饲料，保证营养均衡。
定期进行疫苗接种和抗体检测
制定疫苗接种计划
根据当地疫情和疫苗种类，制定合理的疫苗接种 计划。
定期接种疫苗
按照接种计划，定期对水貂进行疫苗接种，提高 免疫力。
抗体检测
定期对水貂进行抗体检测，了解免疫效果，及时 补种疫苗。
发现病例及时隔离治疗，防止扩散
病原学检查
通过采集病料进行细菌培养、分 离和鉴定，确定病原菌种类。
血清学检查
利用特异性抗体检测水貂血清中的 抗体水平，判断是否感染该病。
分子生物学检测
利用PCR、RT-PCR等技术检测病料 中的病毒核酸，为快速诊断提供支 持。
分子生物学技术在诊断中的应用
病毒基因测序
对病毒基因进行测序分析，了解 病毒的遗传背景和变异情况。
提高了诊断的准确性和效率。
疫苗的应用
02
针对阿留申病的疫苗已经研发成功，并在生产中得到广泛应用
，有效降低了该病的发病率、定期消毒、隔离病貂等措施，有效地控制
了阿留申病的传播。
对未来防治工作的展望和建议
加强监测和预警
建立完善的监测和预警体系，及时发现并控制疾病的爆发和传播 。
03
临床症状与病理变化
临床症状描述
水貂圆环病毒实时荧光定量PCR_检测方法的建立与应用
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为快速检测水貂圆环病毒（MiCV ），本试验根据MiCV Cap 基因序列设计合成特异性引物，建立了水貂圆环病毒SYBR Green II 实时荧光定量PCR 检测方法。
结果显示，该方法在模板浓度为1.0×106 ~1.0×101 copies/μL 范围内呈良好线性关系，相关系数为0.9983。
本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增，批内和批间CV 均小于2%，对重组阳性质粒的检测下限为1.0×101 copies/μL ，比普通PCR 的敏感度高100倍，对阳性样品DNA 的检测下限为2.38×10-2 pg/µL ，比普通PCR 的敏感度高1000倍。
应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测，结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。
上述结果表明，本研究建立的实时荧光定量PCR 检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性，为MiCV 的诊断及流行病学调查提供技术支持。
关键词：水貂圆环病毒；Cap 基因；SYBR Green II 实时荧光定量PCR 方法中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）02-0131-08Development and Application of a Real-time Fluorescence Quantitative PCR DetectionMethod for Mink Circovirus收稿日期：2022-03-03基金项目：吉林省科技发展计划项目（20190304004YY）作者简介：盛陈艳，女，硕士，主要从事经济动物疫病研究通信作者：冷雪，E-mail：******************水貂圆环病毒实时荧光定量PCR 检测方法的建立与应用盛陈艳1，麻宝艺1，李健明2，宫庆龙1，刘 菲1，时 坤2，孙志博5，刘 艺1，冷 雪2，杜 锐2,3,4（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.吉林农业大学中药材学院，长春130118；3.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春130118；4.吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心，长春130118；5.吉林农业科技学院，吉林132101）2024,32(2):131-138Abstract: Specifi c primers were designed according to the Mink circovirus (MiCV) cap gene sequence and synthesized for development of a SYBR Green II real-time fl uorescence quantitative PCR. The results showed that the method had a good linear relationship in the template concentration range of 1.0×106 copies/μL to 1.0×101 copies/μL and the correlation coefficient was 0.9983. This detection method also had no amplifi cations for AMDV , PCV2, MEV , CDV and PRV . The intra-assay and inter-assay CV were less than 2%. The lower limit of recombinant positive plasmid was 1.0×101 copies/μL, which was 100 times more sensitive than the conventional PCR. In addition, the lower limit of detection for DNA of positive samples was 2.38×10-2 pg/µL, which was 1000 times more sensitive than the conventional PCR. Samples were collected from minks, foxes, raccoon dogs and environmental resources on some fur animal farms in Jilin provinceSHENG Chenyan 1, MA Baoyi 1, LI Jianming 2, GONG Qinglong 1, LIU Fei 1, SHI Kun 2, SUN Zhibo 5,LIU Yi1, LENG Xue 2, DU Rui 2,3,4(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. College of Chinese Medicine Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 3. Key Laboratory of Animal Production and Product Quality Safety of Ministry of Education, Changchun 130118, China; 4. Jilin Provincial Engineering Research Center for Efficient Breeding and Product Development of Sika Deer, Changchun 130118, China; 5. Jilin Agricultural Science and Technology University, Jilin 132101, China)· 132 ·中国动物传染病学报2024年4月水貂圆环病毒（Mink circovirus, MiCV）是2014年新发现的一种圆环病毒[1]，水貂感染该病毒后，表现为食欲不佳、精神倦怠、被毛粗乱、腹泻等[2]，且容易引起其他疾病的混合感染[3]。
水貂阿留申病毒最新检测方法研究进展
PCR-DHPLC变性高源自液相色谱分析 （de-naturing high performance liquid chromatography，DHPLC） 是近年来建立并迅速发展的一种新型基 因突变筛查技术。DHPLC 具有高通量检测、自动化程 度高、灵敏度和特异性较高、检测 DNA 片段和长度
[9] 变动范围广、相对价廉等优点。贾赟 （2016） 根据
水貂阿留申病 （Aleutian disease of mink， AD） 是由细小病毒科阿留申病毒属的水貂阿留申病毒 （Aleutian mink disease virus，ADV） 引起水貂的 一种慢性、进行性、免疫抑制性传染病。少数呈急 性经过，大多数呈慢性或隐性感染，不表现明显的 临床症状。该病一方面，引起成貂繁殖能力、皮张 质量、健康状况下降以及死亡率增加；另一方面， 常造成新生幼貂的急性间质性肺炎甚至死亡 。AD
Research Progress on the Detection Methods of the Aleutian Disease of Mink
Zhuang Jinqiu, Mei Jianguo, Wang Yumao, Yao Chunyang, Mo Ling, Shen Zhiqiang
玲， 沈志强
256600）
摘
要： 水貂阿留申病 （AD） 是一种在世界范围内广泛流行的、 严重危害水貂养殖业的病毒性免疫抑制性传染
病。该病尚无有效的疫苗预防， 也无特效治疗方法， 唯一可行的防治方法就是通过定期检疫和淘汰阳性貂， 逐步净 化貂群， 从而达到最终控制和消灭该病的目的。本文综述了该病最新实验室检测方法研究进展， 以期为防控本病提 供参考。 关键词： 水貂阿留申病， 检测， 研究进展 中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1672-9692(2017)11-0053-06
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
３ 临 床 诊 断
３．１ 概 况 水貂阿留申病（ａｌｅｕｔｉａｎｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）又称 浆 细 胞 增 多 症，是 一 种 由 主 要 侵 害 水 貂 免 疫 细 胞 的 阿 留
申病毒（ａｌｅｕｔｉａｎｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＡＤＶ）引起的，导致自身免疫系统紊乱并逐渐衰竭，同时并发 强烈的 自身 免疫的慢性传染性疾病。
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
前 言
本标准按照 ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和 国 吉 林 出 入 境 检 验 检 疫 局、中 华 人 民 共 和 国 北 京 出 入 境 检 验 检 疫
局 、中 华 人 民 共 和 国 江 苏 出 入 境 检 验 检 疫 局 、中 国 农 业 科 学 院 特 产 研 究 所 。 本标准主要起 草 人：王 伟 利、孟 庆 峰、柏 亚 铎、肖 成 蕊、孟 日 增、石 建 平、姜 焱、宋 战 昀、闫 喜 军、
１
犛犖／犜 ２８４７—２０１１
版权所有 · 禁止翻制、电子发售
４ 病 原 分 离 鉴 定
４．１ 仪 器 、试 剂 与 材 料
４．１．１ 仪 器
生 物 安 全 柜 、二 氧 化 碳 培 养 箱 、倒 置 显 微 镜 、高 速 冷 冻 离 心 机 、组 织 匀 浆 器 。 移液器［移液器（２００μＬ～１０００μＬ、２０μＬ～２００μＬ）、吸管（５ ｍＬ、１０ ｍＬ）］细胞培养瓶。
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附录A水貂阿留申病毒荧光PCR检测方法的实验室规范
A.1 实验室设置要求
实验室设置要求如下：
——实验室分为三个相对独立的区域：样本制备区、反应混合物配置区和检测区；
——工作区域须有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用；
——每一区域须有专用的仪器设备
——整个实验过程中均须使用无RNA酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须250 ℃干烤4 h以上，以彻底去除RNA酶；
——各区域的一起设备须有明确标记，以避免设备物品从各自的区域移出，造成不同的工作区域间设备物品发生混淆；
——进入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配置区至检测区；
——在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别；离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出；
——实验室清洁时应该样本制备区、扩增反应混合物配置区至检测区的顺序进行；
——不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
A.2 工作区域仪器设备配置
A.2.1 样本制备区
样本制备区需配置如下仪器设备：
——2℃～8℃冰箱；
——-20℃冰箱；
——高速台式冷冻离心机（4℃，12000r/min）；
——混匀器；
——微量加样器（0.1μL～10μL，5μL～20μL，20μL～200μL，200μL～1000μL）；
——可移动紫外灯（近工作台面）。
A.2.2 检测区
检测区需配置如下仪器设备：
——荧光PCR仪（配计算机）；
——移动紫外灯；
——打印机。
A.3 各工作区域功能及注意事项
A.3.1 样本制备区
样本制备区的功能及注意事项如下：
——样本的保存，核酸提取、贮存及其加入至扩增反应管在样本制备区进行；
——避免在本区域内不必要的走动。
可在本区域内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区造成污染。
为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须立即盖严含
反应混合物的反应管；
——用过的加样器吸头必须放入专门的消毒（例如含次氯酸钠溶液）容器内。
实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始样本、提取过程中样本与试剂的混合
液等）如出现外溅，必须作清洁处理并作出记录；
——对实验台适当的紫外照射（254 nm波长，与工作台面近距离）适合于灭活去污染。
工作后通过移动紫外线灯管来确保实验台面的充分照射。
A.3.2 反应混合物配置区
反应混合物配置区功能及注意事项如下：
——试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行；
——用于标本制备的试剂应直接运送至反应混合物配置区，不能经过检测区，在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒；
——在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。
工作结束后必须立即对工作区进行清洁。
本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠等的化学物
质的消毒清洁作用。
实验台表面用可移动紫外灯（254nm波长）进行照射。
A.3.3 检测区
检测区的功能及注意事项如下：
——PCR扩增及扩增片段的分析在本区内进行；
——本区注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。
为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动；
——完成操作及每天工作后都必须对实验台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。
如有溶液溅出，必须处理并作出记录。
本区的清洁消毒和紫外照射方法同
前面区域。