实验DNA酶切连接及电泳检测
DNA酶切电泳
DNA酶切及电泳陈瑞州 201110424108一、实验目的1.掌握DNA酶切的基本原理和方法；2.学习和掌握琼脂糖点样的基本方法；3.学习判断DNA大小的方法。
二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。
通过将酶切后的DNA片段和标准的已知酶切后片段长度的Maker一起跑电泳后，即可得到条带清晰的电泳图谱，从而推测出各DNA片段的大小。
三、实验材料λDNA；EcoR I酶；HindIII酶；BamHI酶；酶切缓冲液；琼脂糖凝胶；ddH2O；buffer四、实验步骤1.DNA酶切反应HindIII酶 2ul EcoR I酶 2ul BamHI酶 2ul ○1 10Xbuffer 2ul（M）○2 10Xbuffer 2ul（H）○310Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ul λDNA 6ul λDNA 6ulddH2O 10ul ddH2O 10ul ddH2O 10ulEcoR I酶 1.5ulBamHI酶 1.5ul○4 10Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ulddH2O 9ul将灭菌好的离心管编号，用微量移液枪分别加入上述四种反应体系中的试剂，用微量离心机甩一下，使液体集中在管底。
混匀反应体系后，将离心管置于试管架中，于37℃下酶切2-3小时。
2、琼脂糖凝胶电泳用微量移液枪向酶切完全后的上述四个体系的管中各加入2ul loading buffer ，吸取15ul的上述四样液点样，另外两边各用λDNA Marker点样。
于100V下跑电泳30-60分钟，使DNA片段大概跑过凝胶一半左右即可。
于紫外灯下拍照记录。
五、结果分析。
dna的酶切实验报告
dna的酶切实验报告
《探索基因密码：DNA酶切实验报告》
DNA是构成生物遗传信息的重要分子，它携带着生物体的遗传信息，决定了生
物的形态和功能。
而DNA酶切实验则是一种重要的分子生物学实验，通过该实验可以对DNA分子进行精确的切割，从而揭示出DNA的结构和特征。
本报告
将详细介绍DNA酶切实验的步骤、结果和意义。
首先，我们需要准备实验所需的材料和试剂，包括DNA样本、酶切酶、缓冲液等。
接着，将DNA样本与酶切酶和缓冲液混合，并进行恒温反应。
随后，将反应产物进行电泳分析，通过电泳图谱可以观察到DNA分子在电场作用下的迁移情况，从而确定DNA分子的大小和数量。
实验结果显示，经过酶切反应后，DNA分子被切割成不同大小的片段，这些片
段呈现出特定的条带模式。
通过比对电泳图谱和标准DNA片段的大小，我们可以确定DNA分子的酶切位点和切割情况。
这些数据对于研究DNA的结构和功
能具有重要意义。
DNA酶切实验的意义在于揭示了DNA分子的结构和特征，为我们深入了解基
因的组成和功能提供了重要的实验手段。
通过该实验，我们可以对DNA分子进行定量和定性分析，从而揭示出基因的编码规律和变异情况。
这对于生物学、
医学和遗传学等领域的研究具有重要的意义。
总之，DNA酶切实验是一种重要的分子生物学实验，通过该实验可以揭示DNA 分子的结构和特征，为我们深入了解基因的组成和功能提供了重要的实验手段。
希望本报告可以对相关领域的研究工作提供一定的参考和帮助。
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法
DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。
梳子干净晾干有利于梳孔的形成。
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。
3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。
二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。
瓶子。
因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。
保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。
3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。
倒胶时尽量减少气泡的产生。
可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。
梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。
不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。
用枪头赶掉气泡。
高，导致背景太深。
摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。
高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。
4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。
时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。
暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。
电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。
DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳实验原理及步骤
实验6 DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳目的要求（1）掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。
（2）学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。
（3）学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。
原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。
不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电脉时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（菲啶溴红）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。
琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.5—1μg，超薄型平板琼脂糖凝胶电泳所需DNA 可低于0.5μg。
溴乙锭检测DNA，灵敏度很高，10ng（10-9g）或更少的DNA即可检出。
DNA在凝胶中的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。
将未知DNA 的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA 片段的大小。
质粒DNA分子量一般在106—107范围内，如质粒pBR322的分子量为2.8×106。
质粒DNA在细胞内存在可以有3种形式；共价闭环(ccc DNA)、线形DNA和开环的双链环状（opDNA）。
电泳时，同一质粒超螺旋DNA的泳动速度比开环和线形DNA的泳动速度为快。
提取制备的质粒DNA中，常存在超螺旋和开环DNA，在凝胶板上即可显示出2条迁移位置不同的荧光条带（见图34.1）。
本实验采用限制性内切酶Hind Ⅲ或EcoR Ⅰ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘帛出测定DNA分子量的标准曲线。
共价闭环质粒pBR322 DNA只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，酶解后成为一条完整线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。
同时通过与标准pBR322 EcoR Ⅰ酶切图谱的比较分析，可以对提取质粒DNA进行鉴定。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。
实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。
限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。
实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。
2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。
3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。
4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。
实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。
每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。
实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。
通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。
如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。
2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。
如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。
如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。
3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。
酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。
如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。
实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。
这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。
dna酶切实验报告
dna酶切实验报告DNA 酶切实验报告一、实验目的本次 DNA 酶切实验的目的在于掌握 DNA 酶切的基本原理和操作方法，了解限制性内切酶的特性和作用，通过对特定 DNA 片段的酶切，为后续的分子生物学实验如 DNA 连接、克隆和基因分析等提供基础。
二、实验原理DNA 酶切是一种分子生物学技术，基于限制性内切酶对特定 DNA序列的识别和切割作用。
限制性内切酶能够识别双链 DNA 分子中特定的碱基序列（通常为 4 8 个碱基对），并在特定的位点进行切割，产生具有粘性末端或平末端的 DNA 片段。
不同的限制性内切酶具有不同的识别序列和切割方式。
在本实验中，我们使用了具体限制性内切酶名称，其识别序列为具体序列，切割后产生粘性末端/平末端。
三、实验材料与设备1、实验材料待酶切的 DNA 样品（如质粒 DNA 或基因组 DNA）限制性内切酶酶的名称及来源酶切缓冲液琼脂糖上样缓冲液DNA 分子量标准2、实验设备移液器恒温培养箱电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、准备酶切反应体系按照实验要求，在无菌的离心管中依次加入适量的 DNA 样品、限制性内切酶、酶切缓冲液和无菌去离子水，使总体积达到具体体积。
轻轻混匀反应体系，短暂离心使液体集中在管底。
2、酶切反应将离心管放入恒温培养箱中，在设定温度下孵育反应时间。
3、终止酶切反应取出离心管，加入适量的上样缓冲液终止反应。
4、琼脂糖凝胶电泳制备浓度的琼脂糖凝胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液。
将酶切产物与 DNA 分子量标准分别加入凝胶的加样孔中。
接通电源，以电压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移到适当位置。
5、凝胶成像观察电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统中观察并拍照，记录酶切结果。
五、实验结果与分析1、电泳结果通过凝胶成像系统观察到清晰的 DNA 条带。
DNA 分子量标准呈现出预期的条带分布，用于估计酶切产物的大小。
酶切后的 DNA 样品显示出与预期相符的片段大小，表明酶切反应成功。
DNA的酶切与连接1.实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用...
DNA的酶切与连接1. 实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用原理，学习和掌握利用限制性内切酶进行DNA 消化和片段的方法和技术。
2. 实验原理DNA限制性内切酶和连接酶是遗传工程中实现DNA的切割和重组的重要工具酶，也是基因工程技术赖以生存的基础。
1970年Smith H·O等从流感病毒中提取了第一个限制性内切酶Hind II，其作用于外源DNA后，切割产生平末端。
人们经过研究发现，限制性内切酶可以识别双链DNA分子上的特异序列，通常识别区具有回纹结构，并使两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
目前已经从微生物中发现了200多种限制性内切酶，其中大部分可以切割DNA形成粘性末端。
如EcoR I，可以识别6个碱基的序列：▼5’ ――――――GA TTC――――――3’3’ ――――――CTTAAG――――――5’▲切割后形成的片段5’――――――G AA TTC――――――3’3’――――――CTTAA G――――――５’当限制性内切酶作用于DNA时可以形成的酶切片段数为：片段数目= 切点数+1 （线状DNA）片段数目= 切点数（环状DNA）切点出现的频率为1/4s（S为识别顺序所含的碱基数目）DNA连接酶则可以将切开的DNA片段连接起来，此时需要接口两端具有磷酸根。
对粘性末端的单链可以进行点接，对于平末端来说也可以进行连接，但是需要较多的酶。
在基因工程中，可以利用同一种限制性内切酶分别切割目标DNA和运载体，然后利用T4DNA 连接酶将目标序列整合到运载体中，使DNA中的3’-OH与5’-P生成磷酸二酯键。
3. 实验用具及材料电泳仪、恒温水浴锅、紫外检测仪、微量移液器、Eppendorf离心管10×酶切反应缓冲液、T4DNA连接酶缓冲液、溴酚蓝指示液、EB电泳缓冲液、PBR322质粒DNA、pXZ6质粒DNA，λphage DNA、DNA Marker EcoRI Hind III。
质粒DNA提取+电泳+质粒酶切实验报告
实验一：质粒DNA提取+琼脂糖凝胶电泳*实验目的：1.掌握质粒DNA提取的基本原理和方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法*实验原理：1.DNA提取原理1）DNA提取要求：①保证DNA一级结构的完整性；②排除其他分子的污染，使其纯度尽可能提高。
2）DNA样品来源：①培养细胞；②组织样本；③血液样本。
3）主要试剂和材料及仪器：试剂和材料：RNA酶A、细胞悬浮液（Buffer P1)、细菌裂解液（Buffer P2）、中和液（Buffer P3）、漂洗液PW1、漂洗液PW2、洗脱液、质粒DNA吸附柱、滤液收集管仪器：微量移液器、台式微量高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪或凝胶成像系统。
2.电泳原理：1）概念：电泳是指带电粒子在电场中向电势降低的方向移动的现象，移动速度与粒子大小及所带电荷多少有关。
在一定pH条件下，核酸及蛋白质等生物分子呈带电状态，可以进行电泳分析。
2）迁移方向：DNA由负极向正极迁移3）影响目标物迁移速率的因素：分子大小、构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。
4）荧光强度（得率）：荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。
5）琼脂糖凝胶电泳原理：(1)关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子一尤其是蛋白质和核酸。
正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。
通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp大小的DNA片断。
一般琼脂糖胶浓度在0.5%到4%之间，琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。
较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。
(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。
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酶切
样品代 号
成份
ddH2O 无菌水(μl)
pUC1 9
质粒(μl)
10*H E
酶切缓冲液 (μl)
EcoRI酶(μl)
Total(μl)
反应（标准 pUC19)
7
10
2 1.0 20
（二） DNA片段的连接(注：每人一管）
取200 μl的离心管按下表加入试剂。
↓ 混匀后点动离心，将溶液甩至管底
↓ 置于已调好温度为12℃-16℃PCR仪中
↓ 保温1-2h后取出
↓ 电泳检测
样品代号 ddH2O T14 10*T4 T4
成分 ddH2O λDNA/EcoT14 I片段 连接缓冲液 T4DNA连接酶 总体积
用量（μl） 7.0
10.0 2.0 1.0 20
连接
样品代 成分 号
H
ddH2O
T14 λDNA/EcoT14 I片段
Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类
需Mg2+、 SAM及 ATP
仅需Mg2+
需Mg2+及 ATP
识别位点复杂， 特异性差， 切割位点距 识别点远。
识别切割特异性 强，切割发 生在识别位 点。
切割位点在识别 位点周围， 酶活性不单 一。
ห้องสมุดไป่ตู้
命名
一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两 个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如 ，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限 制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到 的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可 以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、 HpaII，MboI、MboII等。
通过DNA重组技术构建DNA重组子
利用限制性核酸内切酶切割DNA+利用DNA连接酶连 接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。
成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主 细胞进行表达提供了有效的实验材料。
限制性内切酶的发现
1965年Werner Arber第一个描述了限制性内切现象； Hamilton O. Smith第一个纯化了限制性内切酶，并鉴定了 其性质； Daniel Nathans用这些酶将SV40病毒的DNA切割成了特定 的片段，并绘制了SV40病毒基因组的“物理图谱”。 1978年这三人获得了当年的Nobel奖。
混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。 ↓
反应结束后， 75℃，保温10min使酶失活。 ↓
电泳检测
样品代号 ddH2O
pUC19 10*H E
成份 无菌水(μl) 质粒(μl) 酶切缓冲液(μl) EcoRI酶(μl) Total(μl)
反应1（标准pUC19) 7 10 2 1.0 20
根据限制酶的识别切割特性、催化 条件及是否有修饰酶活性，可分为 Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重 组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割 后得到的是带粘性末端或平末端的 线性DNA。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA 的甲基化，又催化非甲基化的DNA 的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催 化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ 型 切割位点则在下游 24-26bp 处 。
实验结果分析
关于OD值分析
一40个ugO/mDl2单60n链m单DN位A相或当R于NA于50ug/ml 双链DNA 或 OD260/280: 1.8-2.0 DNA: 1.8 (RNA: 2.0) 比值<1.8：蛋白质污染 比值>2.0: RNA污染
关于电泳条带
质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在 ，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发 生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超 螺旋DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(LDNA)
II型限制性内切酶主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及7个、8个、9个、10个和11个核苷 酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的 是那些识别4个或6个碱基对的限制性内 切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是 一个回文对称顺序，即有一个中心对称 轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全 相同。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端和平头末端。
Buffer 连接缓冲液
T4
T4DNA连接酶
总体积
用量（μl） 7.0 10.0 2.0 1.0 20
（三）质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测
琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7% （0.28g/40ml）和2块1.2%琼脂 糖凝胶（0.48g/40ml）。 （注：全班制备4块胶）
实验目的
1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立； 2、了解影响酶切的因素； 3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立； 4、了解影响连接反应的因素。
Arber W. Smith H.O. Nathans D.
第一个DNA重组分子
1972年Paul Berg等人利用限制性内切酶EcoRI和 连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工 程的开始。
Paul Berg The Nobel Prize in Chemistry 1980
通过DNA重组技术构建DNA重组子
酶切 连接
实 验 原 理 – 酶切
限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特 殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识 别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切 割双链DNA。
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切 核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制 异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无 损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种 切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶 。
质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图
质粒DNA的带型分析
M pUC19
环形质粒DNA 超螺旋粒DNA
出现问题
电泳条带浓度和纯度 电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，
胶未完全凝固） 质粒DNA的带型分析
实验六 DNA的酶切、连接及电泳检
测
实验步骤
（一）质粒DNA酶切(注：每人一管）
在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl） ↓