DH10B大肠杆菌克隆菌株使用说明
DH10B菌株感受态制备,电击转化及转化效率检测
大肠杆菌DH10B（Streptomycin resistant）电转化感受态制备1．从保存的甘油管中取出200 μL菌液到100 mL的LB液体中，37o C，200 rpm 培养约13~16小时后（对数期），按2%接种到SOB培养基中；2．37o C，约2~2.5小时后，OD600约0.5左右，取出，冰上缓慢摇育30 min。
3．预先4o C降温的冷冻离心机离心收集菌体，用预冷的离心管，并时刻保持在冰上，5000 rpm离心5 min；4．用50~60 mL的冰预冷灭菌超纯水洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，第二次洗时可以将2管的菌体并到一管，水洗过程离心的转速要高一些，约6000 rpm离心5 min，因为离心得不是很实，离心完后要立即倒掉上清，以免菌体重新悬浮造成损失；5．用50 mL的冰预冷灭菌10%甘油洗菌体两次，用枪吸打时一定要轻柔，并时刻保持在冰上，离心后立即倒掉上清；6．最后一次甘油洗涤后立即倒掉上清，视菌体量加入0~x μL的10%冰预冷甘油重新悬浮细胞，75~200 μL/管,分装到预冷的离心管中，电转化或立即放入-80o C冰箱保存，该感受态可以在-80o C保存半年。
SOB培养基（1L）：20 g Tryptone；5 g Y east Extract；0.6 g NaCl；0.19 g KCl，8磅灭菌20 min。
注意事项：种子一定要新鲜，最好是从甘油管中直接液体活化的。
OD600控制在0.5左右，建库用的话千万不要过！过了0.6感受态效率不会太高，做一般克隆和质粒转化的要求可以适当放低。
菌体时刻保持冰上（4 o C以下）！尽量减少离开冰的时间。
最后分装的菌体浓度要浓。
对待菌体要尽量轻柔。
收集菌体用的管和枪头要灭菌，并在超净台操作。
电击转化1.75 μL的感受态细胞加入TE溶解的质粒和连接产物最好不要超过0.6 μL，不然容易击穿，如果质粒是用纯水溶解的可以适当提高，冰上放置10~30 min；2.洗干净并烘干的电转杯冰上预冷，快速将上述感受态细胞转到电转杯里，感受态细胞要位于杯子底部；3.此步骤动作要快：将杯子外壁擦干，2 mm的杯子用电转化程序Ec2，1 mm 杯子用电转化程序Ec1，电击后立即加入900~1000 μL37o C预热的SOC（见分子克隆），轻柔吸打，转到2 mL的离心管中，37o C摇床，150 rpm，45~60 min后取适量涂平板。
DH10B 电击感受态细胞使用说明
DH10B 电击感受态细胞DH10B Electroporation Competent CellDH10B 电击感受态细胞基因型F- mcr A ∆(mr r-hsd RMS-mcr BC) φ80lac Z∆M15 ∆lac X74 rec A1 end A1 ara D139 ∆(ara, leu)7697 gal E15 gal K λ- rps L nup GDH10B 电击感受态细胞说明DH10B菌株来源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10B菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (无论真核生物还是原核生物的基因组DNA都能被高效的转入DH10B中)。
recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
φ80dlacZ∆M15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，rpsL赋予其链霉素抗性。
High5TM系列DH10B感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种文库构建。
High5TM系列DH10B感受态细胞经特殊工艺制作，经pUC19质粒检测，转化效率>1010cfu/μg。
注意：DH10B 电击感受态细胞只能用于电击转化而不能用于热激转化。
DH10B 电击感受态细胞操作方法1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的High5TM 系列DH10B感受态细胞放入冰浴中融化，加入1 μl目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒pUC19；B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后适量TE缓冲液(10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。
大肠杆菌基因克隆的基本步骤
大肠杆菌基因克隆的基本步骤嘿，咱今儿个就来聊聊大肠杆菌基因克隆那些事儿！你可别小瞧这大肠杆菌，它在生物领域那可是有着相当重要的地位呢！要进行大肠杆菌基因克隆，第一步，得先找到咱要克隆的那个基因吧。
这就好比你要去一个陌生的地方，得先知道目的地在哪儿呀！得通过各种技术手段，像侦探破案似的，把那个特定的基因给揪出来。
然后呢，就该准备载体啦。
载体就像是一辆小货车，要把基因这个“宝贝”给装进去，拉到它该去的地方。
这小货车可得选好喽，得合适才行，不然基因在里面不舒服可不行。
接下来，把基因和载体连接到一块儿。
这就好像给基因找了个“家”，让它安稳地待在里面。
这连接的过程可得仔细着点儿，不能有一丁点儿差错。
之后，把连接好的载体导入大肠杆菌里。
这就好比把货物运进了仓库。
这导入的方法也有好几种呢，就看哪种适合咱啦。
导入之后，就得让大肠杆菌好好生长啦。
给它提供适宜的环境，就像咱人得住在舒服的房子里一样。
让大肠杆菌在里面开开心心地生活，把咱的基因好好复制。
这时候你可能会问啦，那怎么知道基因克隆成功没呀？嘿嘿，这就得检测啦。
就像考试要看看成绩一样，得知道自己做得对不对。
咱再想想，这基因克隆就像是搭积木，一块一块地搭起来，最后搭成一个漂亮的城堡。
每一步都得小心翼翼，不能马虎。
你说要是中间出了差错会咋样？那可就麻烦啦，就像搭积木搭错了一块，整个城堡可能就歪了或者倒了。
所以每一个步骤都得认真对待呀！你想想，通过这些步骤，咱就能把一个小小的基因复制好多好多份，这多神奇呀！这就是科学的魅力，能让不可能变成可能。
总之呢，大肠杆菌基因克隆虽然听起来挺复杂，但只要咱一步一步慢慢来，肯定能成功。
咱可不能怕困难，要像勇士一样勇往直前！咱要相信，通过咱的努力，一定能在这个领域做出一番大成就！。
高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法)_百替生物
高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法)货号：M050012描述：Hanahan法（1）是制备高效感受态细菌的标准方法。
这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到109cfu/µg DNA，通常用于构建高质量的基因文库，对于普通的克隆操作更是绰绰有余。
对于很难获得有效连接和重组子的困难克隆操作，使用Hanahan法制备的感受态细菌无疑为克隆成功提供了最大保证。
然而Hanahan法的试剂准备相当繁琐，通常用于商业化感受态细菌，通常实验人员难得尝试。
本试剂盒以Hanahan原始文献(1)和《分子克隆实验指南》(2)发表的方法为基础，提供制备新鲜或冻存的高效感受态细菌的全套试剂和简化方案。
重复性甚好，转化效率高，可满足基因文库构建和所有的克隆操作。
组成：20ml Hanahan缓冲液，0.5ml加强液。
可制备100x50µl管高效感受态细菌，进行100-200次转化。
适用：制备新鲜或冻存的高效感受态细菌。
储存：短期4ºC避光，长期-20ºC。
操作步骤1.细菌培养：1.1准备器皿和培养基。
(1)使用洁净培养器皿，用普通复印纸或报纸覆盖瓶口或管口棉线扎紧高压消毒。
(2)厌氧生长的菌体难以达到高感受态。
为保证有氧培养，最好使用250ml三角瓶加入50ml培养基摇菌。
(3)最好用SOB培养基，用SOB要优于LB。
培养基pH值在6.8-7.2，含有20mM MgSO4or20mM MgCl2,，有利于获得高效感受态。
(SOB medium: 2%bacto-trytone,0.5%bacto-yeast extract,0.5%NaCl,2.5mM KCl,20mM MgSO4,pH7.0with NaOH)1.2细菌接种。
取250ml三角瓶加入50ml含10~20mM MgSO4的SOB培养基。
1:100接种冻存的菌液于SOB培养基，注意接种比例随冻存细菌浓度和类型而变。
分子克隆技术实验操作手册
分子克隆技术实验操作手册《分子克隆技术》实验操作手册李香花吴昌银邢永忠华中农业大学生命科学技术学院课程简介分子克隆技术是指DNA的无性繁殖技术。
分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。
实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆、分子杂交和表达检测三部分分子克隆技术：DNA重组技术是分子生物学的核心内容。
本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。
分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有Southern blotting，Northern blotting，Western blotting及Dot blotting 等。
Southern blotting是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后DNA在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜）。
DNA转移至固相支持物的过程中各DNA的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素或DIG)标记的DNA探针与固着在膜上的DNA 杂交，经显影或显色显现出与探针DNA互补的DNA电泳条带的位置，然后进行分析。
本实验要求掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。
系列一分子克隆技术实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
常用大肠杆菌感受态的区别
常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dla cZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体R NA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于B L21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLys S，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DN A产生的L acZa多肽和JM09编码的L acZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5：TOP10菌株该菌株适用于高效的DN A克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
DH10B 电击感受态细胞使用说明
DH10B 电击感受态细胞DH10B Electroporation Competent CellDH10B 电击感受态细胞基因型F- mcr A ∆(mr r-hsd RMS-mcr BC) φ80lac Z∆M15 ∆lac X74 rec A1 end A1 ara D139 ∆(ara, leu)7697 gal E15 gal K λ- rps L nup GDH10B 电击感受态细胞说明DH10B菌株来源于MC1061菌株，mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10B菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (无论真核生物还是原核生物的基因组DNA都能被高效的转入DH10B中)。
recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
φ80dlacZ∆M15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，rpsL赋予其链霉素抗性。
High5TM系列DH10B感受态细胞适用于大质粒的构建或者各种文库构建。
High5TM系列DH10B感受态细胞经特殊工艺制作，经pUC19质粒检测，转化效率>1010cfu/μg。
注意：DH10B 电击感受态细胞只能用于电击转化而不能用于热激转化。
DH10B 电击感受态细胞操作方法1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的High5TM 系列DH10B感受态细胞放入冰浴中融化，加入1 μl目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀立即插入冰中。
A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒pUC19；B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后适量TE缓冲液(10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。
DH10Bac 的感受态制作
DH10Bac™ E.coli感受态细胞制备方法（希望对大家有用）1、用牙签蘸取少量DH10Bac感受态细胞，接种至3ml包含50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的LB液体培养基中，37℃下震荡培养12h左右，直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100的比例接种于100ml 包含50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的LB液体培养基中，37 ℃230 rpm振荡培养1h后，开始测定OD600值,以后每隔十分钟测定一次,直到OD600约0.4。
当OD600值达到0.35左右时,收获细菌培养物。
（由于细菌呈对数生长，所以后期测定OD600值时不必等到10 min，避免错过OD600值为0.4这个时间点。
）（一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌活细胞109个/ml。
为了达到高效转化，活细胞数务必少于108个/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于OD600值为0.4左右。
为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15～20min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD600值列一个表，以便预测培养物的OD600值达到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
）2、将细菌培养液转入无菌的预先用冰预冷的50 ml离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃，然后于4℃下4100 rpm离心10min，以回收细胞；3、弃尽上清，没50 ml初始培养物加入30 ml预先用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟，然后于4℃下4100 rpm离心10min，以回收细胞；4、弃去上清，加入1～2 ml预先用冰预冷的15﹪无菌甘油的0.1 mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；5、将感受态细胞分装成100 ul/Tube，-80 ℃保存。
备注：1、感受态制备的整个过程中应当严格无菌操作；2、提前配制包含工作浓度为50 ug /ml的卡那霉素和10 ug/ml的四环素的LB培养基100 ml，其中添加100 mg /ml的卡那霉素50 ul，10 mg/ml的四环素100 ul。
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DNA 的提取。 φ80dlacZ∆M15 marker 的存在使 DH10B 可用于蓝白斑筛选，
rpsL 赋予其链霉素抗性。对 DH10B 使用 LB，在 37℃有氧的环境下培养，
然后使用 30%的甘油保藏菌种，42℃热激处理可将质粒成功转入 DH10B
中 。
操作说明：
注 意 事 项 ： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放 置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能 正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接
genomic DNA , both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently
in DH10B）。recA1 和 endA1 的突变有利于插入 DNA 的稳定和高纯度质粒
DH10B 大肠杆菌克隆菌株
编号
名称
北京华越洋生物 NRR01180 DH10B 大肠杆菌克隆菌株
基 本 信 息 ：
名称：DH10B 大肠杆菌克隆菌株
规格：300ul 甘油菌
储 存 温 度 ： -‐80℃
基 因 组 ：
简 介 ：
DH10B 菌株来源于 MC1061 菌株，mcrA、mcrBC 及 mrr 突变使 DH10B
菌 株 适 合 于 克 隆 富 含 甲 基 胞 嘧 啶 或 甲 基 腺 嘌 呤 的 DNA （ Therefore ,
F-‐ mcrA ∆(mrr-‐hsdRMS-‐mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 endA1
araD139 ∆(ara, leu)7697 galE15 galK λ-‐ rpsL nupG
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h