AKTA Primer 层析系统在天然产物分离中-实验.ppt
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AKTA 层析分离技术PROTEINPPT课件
Ni2+
15
任何规模纯化都比较简单
预装柱/填料
His MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 融合蛋白的量
〈 100 µg
HiTrap™ Chelating 1 ml HisTrap™ Kit
〈 12 mg 〈 12 mg/柱
3:
洗脱GST 融合蛋白
kD
94 67 43 30 20.1 14.4
12 3
Glutathione Sepharose™ Fast Flow
适合装填在高效层析柱中和层析系统结合使用， 并用作放大
• 每毫升填料可以纯化 12 mg 融合蛋白 • 装在 XK 空柱中和 ÄKTA™ 平台纯化
系统连接使用 • 高流速 • 兼容尿素，盐酸胍等
立即可用, 预装柱, 缓冲液和试剂 和 MicroPlex™ 24 Vacuum 结合使用可以大大增加处理量 (一次处理〈 48 样品) 立即可用, 预装柱 立即可用, 预装柱 可自行装柱 可自行装柱，使用层析系统快速纯化， 适合放大
6
GST MicroSpin™ Purification Module
一次可纯化 GST 融合蛋白的量
〈 400 µg
GSTrap™ 1 ml
10 - 12 mg
GSTrap 5 ml
50 - 60 mg
Glutathione Sepharose™ 4B 8 mg / ml
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow
10 -12 mg / ml
注意
提供分子量大小和 % 纯度讯息. 可检测融合蛋白和污染物.
13
GST 96-孔板 ELISA 检测试剂盒
akta层析系统参数
AKTA层析系统参数1. 介绍AKTA层析系统是一种高效且可靠的分离技术，用于生物分子的层析纯化。
层析系统参数是指在使用AKTA层析系统时需要设定的一系列参数，包括流速、洗脱梯度、柱温等。
正确设置这些参数能够保证分离效果和纯化纯度。
在本文中，我们将详细探讨AKTA层析系统参数的选择和优化，帮助您合理使用该系统并取得最佳的分离效果。
2. 流速参数流速是指液相在层析柱中的通过速率。
流速参数的选择对于分离效果和纯化纯度有很大的影响。
2.1 比线速度比线速度是流速参数的常用表示方法，其定义为单位时间内液相通过层析柱截面积的体积。
一般来说，比线速度越大，分离效果越好，但可能会降低纯化纯度。
建议在初始实验阶段采用较低的比线速度，然后根据样品的性质和分离需求逐步调整。
2.2 线速度线速度是流速参数的另一种表示方法，其定义为单位时间内液相通过层析柱的线性距离。
线速度与比线速度之间存在线性关系，可以相互转换。
3. 洗脱梯度参数洗脱梯度是指在层析过程中逐渐改变洗脱缓冲液的成分，以实现分离目标。
洗脱梯度参数的选择对分离效果和纯化纯度起着至关重要的作用。
3.1 起始缓冲液起始缓冲液是指开始层析时的溶液组成。
一般来说，起始缓冲液的性质应与待纯化物质相似，以提高分离效果。
如果待纯化物质溶解在缓冲液中，可以选择与之相同或类似的缓冲溶液。
3.2 洗脱缓冲液洗脱缓冲液是指在层析过程中使用的溶液，通过改变洗脱缓冲液的成分来实现分离目标。
选择合适的洗脱缓冲液需要考虑待纯化物质的亲和性和纯化纯度要求。
3.3 洗脱梯度洗脱梯度是指在层析过程中逐渐改变洗脱缓冲液的组成。
一般来说，采用线性梯度或者非线性梯度都可以实现分离效果。
线性梯度容易操作，但纯化纯度可能相对较低；非线性梯度可以提高纯化纯度，但操作难度较大。
根据实验要求和待纯化物质的特性选择合适的洗脱梯度。
4. 柱温参数柱温是指在层析过程中控制的柱子温度。
柱温参数的选择对于柱子的稳定性和分离效果有一定影响。
2 天然产物的提取分离和结构鉴定课件PPT
15
1溶剂法
1、溶剂提取法及其原理
溶剂提取法：是根据天 然产物中各种成分在溶 剂中的溶解性质，选用 对活性成分溶解度大， 对不需要溶出成分溶解 度小的溶剂，而将有效 成分从药材组织内溶解 出来的方法。
原理：根据“相似相溶” 原理，选择与化合物极 性相当的溶剂将化合物 从植物组织中溶解出来， 同时，由于某些化合物 的增溶或助溶作用，其 极性与溶剂极性相差较 大的化合物也可溶解出 来。
Chapter 2
天然产物的提取分离和结构 鉴定
2021/3/10
1
教学目的与要求：
•了解天然产物化学的预实验与提取 •掌握天然产物化学成分提取分离的原理及方法 •掌握色谱分离方法 •了解天然产物化学结构的测定方法
2021/3/10
2
主要内容
❖ 一、天然产物化学成分的预实验与提取 ❖ 二、色谱分离分析方法 ❖ 三、结晶和重结晶 ❖ 四、天然产物化学成分的结构鉴定
2021/3/10
26
煎煮法
操作方法
将天然物原料 粗粉加水加热煮 沸，使其成分提 取出来的方法。
特点
此法简便，原料中大部 分成分被不同程度地提出， 但含挥发性成分及有效成分 遇热易破坏的原料不宜用此 法，对含有多糖类原料，煎 煮后，溶液比较粘稠，过滤 比较困难
2021/3/10
27
回流提取法：
应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免 溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接 回流冷凝器。溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴 中加热回流，一般保持沸腾约1小时后放冷过滤，再 在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半 小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率
•极性最大的有机溶剂：甲醇
【精品】AKTA-Primer-层析系统在天然产物分离中-实验教学课件精品课件
面板(miàn bǎn)操作按钮
分布(fēnbù)收集器前进一 管
停止(tíngzhǐ)程序或方法运 行 梯度运行过程中，按此键，系统将保持 当前浓度运行，而流速和分步收集继续， 再按一下，继续梯度运行
按此键，系统暂停运行，包括泵和收集， 再按一下，继续
第十三页，共26页。
操作命令简介(jiǎn jiè) 主菜单(cài dān)
第十四页，共26页。
预编好的方法(fāngfǎ) 模板
运行保存(bǎocún)的方 法
手动运行(yùnxíng)
编辑方法 将方法拷入电脑或拷回
设定系统参数
检操作命令简介(jiǎn jiè)
子菜单(cài dān)
以Manual Run为例：
第十六页，共26页。
单位(dānwèi) ml、min
第十八页，共26页。
运行曲线(qūxiàn)图谱 （Curve）： 记录系统采集到的全部数据，系 统开始运行后，自动开始记录， 结束后，自动保存。
运行日志（Logbook）： 记录系统(xìtǒng)收到的所有指 令
第十九页，共26页。
AKTA Primer
第二十页，共26页。
AKTA Primer
min梯度运行过程中按此键系统将保持当前浓度运行而流速和分步收集继续再按一下继续梯度运行按此键系统暂停运行包括泵和收集再按一下继续第十三页共26页
第一页，共26页。
基本知识
现代柱层析技术(jìshù)的原理
Principles of Operation for Chromatography Techniques
PrimeView——数据(shùjù)采集
选择浏览曲线 (qūxiàn)及设定曲 线(qūxiàn)颜色
AKTApilot
图 6. UV 流动池。
压力和空气传感器 系统有四个压力传感器测定压力。有两个传感器恰好位于柱 前和柱后，可以读出经过柱的压力差异。另外两个压力传感 器位于泵后，以保证在高压下流速快速停止时的安全。在系 统中有两个不同的空气传感器，一个用于加样，另一个用于 柱的保护。 空气传感器使用超声技术检测流经液体中的空气， 与在 AKTA 和 BioProcessTM 系统中使用的空气传感器有相同功 能。
图 8. 用 SOURCE 30 Q 进行精细纯化的 AKTApilot 和 AKTAexplorer 100 的层析图谱。
.5.
AKTApilot
可靠的灭菌
AKTApilot 的灭菌效率经受了灭菌程序的测试，该法用 1 M 氢 氧化钠 (NaOH) 作为杀菌剂进行微生物攻击实验。 系统用包括 由美国药典 United States Pharmacopoeia (USP 25) 推荐的三 个细菌系和一种通常用于生产环境的酵母菌系的溶液感染系 统 (表 1)。USP 25 要求菌落形成单位呈 log 6 减少。
AKTApilot — 系统规格
系统流速 非梯度和梯度 双模式 操作压力 表 1. 攻击的微生物 UV 波长范围
=
FDA 21 CFR Part 11
!"#$%!
!
== = == =
=
!" #$%&'()*$+ !"#$"% !"#$% !
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AKTApure层析系统
流速：
0.5 ml/min
系统：
ÄKTA pure
选配的进样阀是为了与样品泵一起使用。它允许多达 7 个 不同样品的快速、自动进样。整合的空气传感器确保安全 和完整的上样，无需预先设定样品体积。阀门有 7 个进样 位置和一个专门的缓冲液进口，用于在样品上样前利用缓 冲溶充满样品泵，以及用于两个样品上样之间冲洗阀门和 泵。在进样过程中，当样品完全上样时空气感应器开始检测，
图 1. ÄKTA pure 是一种用于蛋白质、肽和核酸在实验室规模的可靠纯化的 灵活层析系统。
用于层析柱夹和设备连接的多轨道位于仪器的前部和一侧。 仪器顶部的缓冲液托盘提供容器和收集瓶的存放区域。仪 器的控制面板显示系统的状态，并且可以通过触摸按钮进 行运行操作（暂停 / 继续）。
基 本 配 置 的 系 统 仅 重 48 kg， 选 择 所 有 选 配 组 件 时 重 53 kg。相对低的重量使它能够更简单地被放置在实验台上， 系统尺寸使它可以更方便地安装在标准的层析冷柜中，用 于不稳定样品的纯化。
多柱位阀整合两个压力传感器；第一个传感器检测层析柱 前压力，能够保护层析柱的硬件，而第二个传感器检测层 析柱后的压力。通过测量两个压力读数之间的差值可以计 算层析填料上的压差（Δp），保护装填好的柱床（图 5）。
ဣཥԭუ૰ Pre-
0.6 MPa
CP
֫ဆዹۥև ᆘॲუ૰
0.5 MPa
֫ဆዹ གଙუ૰ (∆p)
于使用不同大小的流动器以同时检测低浓度和高浓度蛋白。 入口选择阀 V9-IAB 在单个阀门中含有 4 个进口位置，可为
电导检测器
缓冲液自动化选择和进行基本层析时层析柱和系统运行后
的清洗提供便利。 电导检测器用于监测缓冲液和样品的电导率，在线检测真
AKTA--实验室层析柱装柱技术介绍PPT演示课件
ml 36.14 118.54
Area
mAU*ml 50.6325
0.7791
Area/Peak area
(volume) % 98.48 1.52
Height
mAU 16.974
0.131
4
Column packing
N/m= 5.54 (Ve/Vh)2100/L As = b/a
5
Column packing
Column packing
• 好的柱效是层析成功的关键 • 不同种类的凝胶、不同的层析柱有不同的装柱方法 • 柱效测定的方法 • 层析柱的维护
2
Column packing
mAU
Sr4FF01:1_rabies vaccine
1500
1000
500
Rabies vaccine Sepharose 4 Fast Flow 5% column vol sample
13
Column packing
➢ Sepharcyl S HR
Flow rates given below. Pack the gel in STEP 1 for 2 hours or until the gel has reached a constant height, then increase the flow rate to the value listed for STEP 2 and pack for 60 minutes.
the ➢ column was not properly equilibrated. ➢ To check that the bed is stable, run the column at 70% packing ➢ pressure for 20 hours and test it again (preferably three test runs). ➢ Note that pressure spikes may cause poor packing (cracking). If ➢ this happens, an air trap and a pressure relief valve are needed ➢ between the pump and the column. The pressure relief valve ➢ should be placed between the air trap and column.
Area
mAU*ml 50.6325
0.7791
Area/Peak area
(volume) % 98.48 1.52
Height
mAU 16.974
0.131
4
Column packing
N/m= 5.54 (Ve/Vh)2100/L As = b/a
5
Column packing
Column packing
• 好的柱效是层析成功的关键 • 不同种类的凝胶、不同的层析柱有不同的装柱方法 • 柱效测定的方法 • 层析柱的维护
2
Column packing
mAU
Sr4FF01:1_rabies vaccine
1500
1000
500
Rabies vaccine Sepharose 4 Fast Flow 5% column vol sample
13
Column packing
➢ Sepharcyl S HR
Flow rates given below. Pack the gel in STEP 1 for 2 hours or until the gel has reached a constant height, then increase the flow rate to the value listed for STEP 2 and pack for 60 minutes.
the ➢ column was not properly equilibrated. ➢ To check that the bed is stable, run the column at 70% packing ➢ pressure for 20 hours and test it again (preferably three test runs). ➢ Note that pressure spikes may cause poor packing (cracking). If ➢ this happens, an air trap and a pressure relief valve are needed ➢ between the pump and the column. The pressure relief valve ➢ should be placed between the air trap and column.
天然产物化学成分提取分离方法PPT讲稿
皂苷、强心苷、甾体：其乙酐溶液与浓硫酸反应 后显示各种颜色皂苷； 水溶液振荡时能产生大量 泡沫。
酚类：与三氯化铁反应显示各种颜色。 糖苷类：与斐林试剂反应有砖红色沉淀生成。 有机酸：与溴酚蓝反应显黄色。 氨基酸、多肽：与茚三酮反应显蓝紫色。 蛋白质：双缩脲反应显紫红色。
（二）天然产物化学成分的系统提取分离
氯仿或乙酸乙酯——游离的生物碱、有机酸、 黄酮、香豆素等苷元
甲醇、乙醇、丙酮——苷类、生物碱、鞣质
水——氨基酸、糖类、无机盐
常用提取溶剂的性能特点
提取溶剂
性能特点
适宜提取成分
强极性溶剂
溶解范围广
生物碱盐
水
穿透能力强
法
苷类
易得、安全
糅质
法
糖类
有些脂溶性成分溶解不完全; 氨基酸
有些苷类成分易酶解变质;
• 1.系统溶剂提取——选择几种不同极性的溶
剂，由低极性到高极性进行分步提取， 使
各成分依其在不同极性溶剂中的溶解度不 同而得以分别提取出来。
• 常用的两种溶剂系统为： • （1）己烷—乙醚—甲醇—水 • （2）己烷—二氯甲烷—甲醇—水
•2.单一溶剂提取——根据水可提取极性成分，石 油醚可提取非极性成分，醇能提取大部分成分 的特点，用一种溶剂将性质相近的组分集中在 一起提取出来。
1.化学成分的极性:被提取成分的极性是选择溶剂 的最重要依据
(1)常见天然产物化学成分类型的极性： 极性较大的：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、
鞣质、小分子有机酸、亲水性色素。 极性小的：游离生物碱、苷元、挥发油、树脂、脂肪、大
分子有机酸、亲脂性色素。 (2)影响化合物极性的因素: ①化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，
酚类：与三氯化铁反应显示各种颜色。 糖苷类：与斐林试剂反应有砖红色沉淀生成。 有机酸：与溴酚蓝反应显黄色。 氨基酸、多肽：与茚三酮反应显蓝紫色。 蛋白质：双缩脲反应显紫红色。
（二）天然产物化学成分的系统提取分离
氯仿或乙酸乙酯——游离的生物碱、有机酸、 黄酮、香豆素等苷元
甲醇、乙醇、丙酮——苷类、生物碱、鞣质
水——氨基酸、糖类、无机盐
常用提取溶剂的性能特点
提取溶剂
性能特点
适宜提取成分
强极性溶剂
溶解范围广
生物碱盐
水
穿透能力强
法
苷类
易得、安全
糅质
法
糖类
有些脂溶性成分溶解不完全; 氨基酸
有些苷类成分易酶解变质;
• 1.系统溶剂提取——选择几种不同极性的溶
剂，由低极性到高极性进行分步提取， 使
各成分依其在不同极性溶剂中的溶解度不 同而得以分别提取出来。
• 常用的两种溶剂系统为： • （1）己烷—乙醚—甲醇—水 • （2）己烷—二氯甲烷—甲醇—水
•2.单一溶剂提取——根据水可提取极性成分，石 油醚可提取非极性成分，醇能提取大部分成分 的特点，用一种溶剂将性质相近的组分集中在 一起提取出来。
1.化学成分的极性:被提取成分的极性是选择溶剂 的最重要依据
(1)常见天然产物化学成分类型的极性： 极性较大的：苷类、生物碱盐、糖类、蛋白质、氨基酸、
鞣质、小分子有机酸、亲水性色素。 极性小的：游离生物碱、苷元、挥发油、树脂、脂肪、大
分子有机酸、亲脂性色素。 (2)影响化合物极性的因素: ①化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，
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AKTA Primer
AKTA Primer
PrimeView——数据采集
选择浏览曲线及 设定曲线颜色
设定X，Y轴的 坐标范围
实验的基本内容
实验题目——蛋白质脱盐
实验目的 1.了解层系技术的理念，基本操作和应用 2.掌握分子筛层析的原理，了解其用途； 3.熟悉AKTA Prime 的操作。 实验原理
AKTA Primer
AKTA Primer 系统组成
AKTA Prime + PrimeView
AKTA Primer
AKTA Prime 主机
组分收集器
控制面板
系统泵
AKTA Primer
AKTA Prime 主机
AKTA Primer
AKTA Prime 流程图
AKTA Prime系统的应用技术
基本知识
现代柱层析技术的原理
Principles of Operation for Chromatography Techniques
Gel Filtration
Ion Exchange
Hydrophobic Interaction Affinity
实验材料
层析介质 葡聚糖凝胶——G25 分离对象 脱除含1M硫酸铵的小牛血清中的盐 实验试剂 0.15M的氯化钠溶液
实验注意事项
设置限压0.3MPa。 排尽注射器内的空气，从上样阀注入样品环， 注射器放在原位不拔出。
实验思考题
蛋白质分离纯化的方法有哪些？请列举2种以 上，并阐述其原理。 利用凝胶层析法分离混合样品时，怎样才能得 到较好的分离效果？ 现有含谷氨酸(Glu)、甘氨酸（Gly）、赖氨酸 (Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)的混合溶液， 请设计一个实验对其进行分离，写出实验基本 步骤并预测实验结果。
Reversed Phase
基本知识
层析介质
硅胶 氧化铝 聚酰胺 大孔树脂 分子筛凝胶 离子交换凝胶 亲和层析介质 反相层析介质
基本知识
AKTA--分离和纯化各类生物分子
•天然蛋白质 •重组和融合蛋白质 •肽类 •寡核苷酸 •质粒 •病毒 •抗生素 •生物碱, TCM •。。。。。。等等
限压 （保护层析柱） MPa 缓冲阀位 1-8
样品阀位 waste、load、inject
开始
AKTA Primer
PrimeView——软件系统-数据采集
运行曲线图谱（Curve）：
记录系统采集到的全部数据， 系统开始运行后，自动开始记 录，结束后，自动保存。
运行日志（Logbook）： 记录系统收到的所有指令
面板操作按钮及简要操作命令
面板操作按钮
面板操作按钮
按OK进入子菜单； 按ESC退到上级菜单；
按上下箭头，可选择菜单命令、调整参数等。
面板操作按钮
分布收集器前进一管 停止程序或方法运行 梯度运行过程中，按此键，系统将保 持当前浓度运行，而流速和分步收集 继续，再按一下，继续梯度运行 按此键，系统暂停运行，包括泵和收 集，再按一下，继续
操作命令简介
主菜单
预编好的方法模板 运行保存的方法 手动运行
编辑方法
将方法拷入电脑或拷回 设定系统参数 检查系统状态
操作命令简介
子菜单
以Manual Run为例：
单位 ml、min
浓度 %B 梯度 （长度ml/目标浓度%B） 流速 ml/min 收集单位 ml、min、drop
收集数量 （每管）