淋巴细胞分离实验..
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免疫学实验一
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离 原理 试剂和仪器 实验步骤 注意事项
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
红细胞
1.093 1.092
淋巴细胞分层液（ Ficoll ，低温避光保 存），Hanks液，RPMI1640，PBS，小 牛 血 清 ， 华 氏 管 ， 50ml 离 心 管 ， 2ml （5ml）吸管，水平离心机
注意事项
1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加， 以免冲散界面 4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上 清液或分层液而导致血小板污染
淋巴细胞 单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀 释 外 周 血
稀释的血浆、 血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
Ficoll
Ficoll
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的 管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带 气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀 释不当，需重新制备细胞悬液、计数
实验步骤
3.20℃，1500r/min，离心30min
4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入 另一试管中
实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min 离心10min ，弃上清 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min， 弃上清 7.适量的培养基重悬细胞 ，计数
试剂和仪器
实验要求
华氏管中加入血样后，用记号笔作好 标记 实验完毕后，请清洗试管、吸管和计 数板
试验报告要求
试验内容 (原理、步骤), 结果 试验注意事项
细胞计数
试剂和仪器 实验步骤 注意事项
试剂和仪器
血球计数板，盖玻片，Hanks液， RPMI1640，2ml（5ml）吸管，华氏 管，移液尖，微量移液器，显微镜
实验步骤
Байду номын сангаас
1、准备计数板： 2 、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞 悬液 3 、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许 细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4 、计数：在显微镜下，用 10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离 原理 试剂和仪器 实验步骤 注意事项
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
红细胞
1.093 1.092
淋巴细胞分层液（ Ficoll ，低温避光保 存），Hanks液，RPMI1640，PBS，小 牛 血 清 ， 华 氏 管 ， 50ml 离 心 管 ， 2ml （5ml）吸管，水平离心机
注意事项
1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加， 以免冲散界面 4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上 清液或分层液而导致血小板污染
淋巴细胞 单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀 释 外 周 血
稀释的血浆、 血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
Ficoll
Ficoll
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的 管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带 气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀 释不当，需重新制备细胞悬液、计数
实验步骤
3.20℃，1500r/min，离心30min
4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入 另一试管中
实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min 离心10min ，弃上清 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min， 弃上清 7.适量的培养基重悬细胞 ，计数
试剂和仪器
实验要求
华氏管中加入血样后，用记号笔作好 标记 实验完毕后，请清洗试管、吸管和计 数板
试验报告要求
试验内容 (原理、步骤), 结果 试验注意事项
细胞计数
试剂和仪器 实验步骤 注意事项
试剂和仪器
血球计数板，盖玻片，Hanks液， RPMI1640，2ml（5ml）吸管，华氏 管，移液尖，微量移液器，显微镜
实验步骤
Байду номын сангаас
1、准备计数板： 2 、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞 悬液 3 、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许 细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4 、计数：在显微镜下，用 10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数