淋巴细胞分离实验..
2--淋巴细胞分离技术及玫瑰花环试验
二、实验目的
了解血液中的各种细胞成分及特性。
掌握实验动物外周血中淋巴细胞的分离方法 掌握T、B淋巴细胞的区分方法及T淋巴细胞的计 数方法。
三、实验材料
1. 兔淋巴细胞分离液、 1%绵羊红细胞、 生理盐水、 pH6.4的PBS液、 Hank,s液、瑞氏染色液（I 液）、吉姆萨染色液（II液）、香柏油、二甲苯、 甲醇、 碘酊棉球、75%酒精棉球。 2. 50mL注射器，10ml玻璃离心管、50ml离心管、擦镜纸、 移液枪（枪头）、载玻片、巴氏吸管、镊子等。 3. 显微镜、离心机、
实验五
（一）淋巴细胞分离技术 （二）E玫瑰花环试验
一、实验原理
(一）淋巴细胞的分离：
兔淋巴细胞的方便来源是外周血，此次实验 采用的就是聚蔗糖溶液的密度梯度离心法。外周 血中各种细胞的密度不同，红细胞和多核白细胞 的比重密度较大，1.090左右，淋巴细胞和单核 细胞的密度为1.075～1.090。密度梯度离心法的 原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重 介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心， 使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不 同的独立带，从而达到分离的目的。
SRBC受体(Sheep red blood cell)
T细胞
SRBC
Erythocyte rosette test
红细胞玫瑰花环形成试验
T
B
T
erythrocyte antibody rosette formation test 红细胞抗体玫瑰花 环形成试验
erythrocyte antibody complement rosette formation test 红细胞抗体补体玫 瑰花环形成试验
四、实验步骤
人周血淋巴细胞分离液技术要求
人周血淋巴细胞分离液技术要求引言：人周血淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们对于疾病的预防和治疗具有重要意义。
因此，人周血淋巴细胞分离液技术的发展和应用具有重要的临床和科研意义。
本文将从实验设备、试剂和实验操作等方面介绍人周血淋巴细胞分离液技术的要求。
一、实验设备1.高速离心机：用于离心样品，获得血细胞和血浆分离。
2.恒温振荡器：调节培养基的温度和震荡条件，确保细胞的生长和生存条件。
3.显微镜：观察细胞培养的状况，判断细胞的活性和纯度。
4.细胞计数仪：准确计算细胞数目，掌握细胞的生长和增殖情况。
二、试剂2.淋巴细胞分离液：选择合适的分离液，如密度梯度离心法、免疫磁珠分离法等。
分离液应具有高分离效率和良好的细胞生存率。
3.培养基：如RPMI-1640培养基等，含有必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子等，提供细胞所需的养分和生存环境。
4.细胞增殖试剂：如PHA（植物血球凝集素）、IL-2（白细胞介素-2）等，用于促进淋巴细胞的增殖和活化。
5.细胞保存液：含有冻存缓冲剂和细胞保存剂，保证细胞冷冻保存时的细胞活性和纯度。
三、实验操作2.制备分离液：根据所选的细胞分离方法，制备稀释好的分离液，注意消毒操作，避免污染。
3.样品离心：将血样离心分离，获得血浆和血细胞层。
4.加入分离液：将分离液缓慢注入离心管中，加入足量的分离液以确保细胞的分离效果。
5.离心分离：根据分离液的密度和离心速度，进行适当的离心分离操作，获得淋巴细胞层。
6.细胞计数和检测：使用细胞计数仪计数和检测细胞的活性和纯度，根据需求调整细胞浓度。
7.细胞培养：将分离得到的淋巴细胞进行培养，在恒温振荡器中培养细胞，提供养分和生长环境，促进细胞的增殖和活化。
8.细胞保存：将培养得到的淋巴细胞分装到冻存管中，添加细胞保存液，迅速置于液氮中进行冻存，保存好的细胞可供后续实验和应用。
结论：。
PBMC的分离培养及处理步骤
刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。
2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。
3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。
4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。
5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。
6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。
7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。
①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。
②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。
细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。
（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。
9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。
（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。
10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。
11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。
(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。
(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。
(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。
（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106
个/ml备用。
1/ 1。
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。
淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。
本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。
实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
注意避免气泡的产生。
2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。
离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。
3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。
轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。
此步骤的目的是去除红细胞和血浆。
4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。
注意避免两种液体混合。
离心管中的液体应该形成明显的两层。
5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。
离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。
6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。
加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。
7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。
8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。
同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。
结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。
在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
实验二：淋巴细胞分离实验
6
实验步骤
1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨 （研磨同时滴加1640培养液，保持细 胞活性）
2. 细胞混合液静置数分钟后吸管吸取， 沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层 液上方（Ficoll：血细胞=1：1）
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7
实验步骤
3.2000r/min，离心15min
4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移 入另一试管中
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意事项
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2
目的
熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
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3
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
释不当，需重新制备细胞悬液、计数
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15
试验报告要求
原理, 步骤, 结果, 讨论。
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16
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4
原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
可编辑版
5
稀
释
外
周
血
1500rpm,
20℃ , 30min
Ficoll
Ficoll
可编辑版
稀释的血浆、 血小板 PBMC
可编辑版
8
实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清
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细胞计数
试剂和仪器 实验步骤 注意事项
试剂和仪器
血球计数板，盖玻片，Hanks液， RPMI1640，2ml（5ml）吸管，华氏 管，移液尖，微量移液器，显微镜
实验步骤
1、准备计数板： 2 、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞 悬液 3 、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许 细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4 、计数：在显微镜下，用 10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
实验要求
华氏管中加入血样后，用记号笔作好 标记 实验完毕后，请清洗试管、吸管和计 数板
试验报告要求
试验内容 (原理、步骤), 结果 试验注意事项
实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带 气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀 释不当，需重新制备细胞悬液、计数
淋巴细胞分层液（ Ficoll ，低温避光保 存），Hanks液，RPMI1640，PBS，小 牛 血 清 ， 华 氏 管 ， 50ml 离 心 管 ， 2ml （5ml）吸管，水平离心机
注意事项
1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加， 以免冲散界面 4. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上 清液或分层液而导致血小板污染
淋巴细胞 单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀 释 外 周 血
稀释的血浆、 血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
Ficoll
Ficoll
红细胞 粒细胞
实验步骤
1.采血，稀释 （外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的 管壁缓缓加入稀释的外周血 （Ficoll：稀释血=1：2）
实验步骤
3.20℃，1500r/min，离心30min
4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入 另一试管中
实验步骤
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min 离心10min ，弃上清 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min， 弃上清 7.适量的培养基重悬细胞 ，计数
试剂和仪器
免疫学实验一
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离 原理 试剂和仪器 实验步骤 注意事项
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
原理
红细胞
1.093 1.092