脾脏分离淋巴细胞
脾脏淋巴细胞分离方法
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。
（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。
小鼠脾脏单个核细胞分离
-
特异性 敏感性
优点
缺点
细胞生物 低 学方法 免疫学方 高 法
分子生物 高 学方法
高
可确定活 性
易操作， 可大量检 测 既可定量 又可定位
繁琐费时 不能确定是 否有活性
不能反映浓 度和活性
较高
高
小鼠脾单个核细胞的分离—密度梯度离心法
原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗 粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同 的分布位置。利用此原理可设计一定密度的液体 界面，将各种不同密度的细胞通过离心沉降而达 到使其彼此分离的目的。已知小鼠淋巴细胞和单 核细胞的密度大约在1.088之间，而红细胞与粒细 胞 的 密 度 均 大 于 1.088 。 因 此 ， 若 用 密 度 为 1.088±0.001 的分离液则可通过密度梯度离心方 法，在分离液界面上收集单个核细胞。
T:表达CD2(SRBC受体） B:不表达CD2
免疫细胞功能检测
淋巴细胞转化试验
细胞毒试验
细胞因子检测 溶血空斑实验
T
PHA, ConA,PWM
或Ag
形态学观察Lc 与淋巴母细胞 的比值
3H-TdR掺入法测cpm值
细胞因子检测
细胞生物学方法: CK细胞敏感株
密度梯度离心法
聚蔗糖—泛影葡胺 Ficoll-Hypaque: 1.088±0.001
LC, M :1.088 RBC, 粒细胞：>1.092
在1ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有 2ml淋巴 细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。 将该试管置水平式离心机中离心（1800rpm）15分钟。 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细 胞），吸出界面层细胞，移入另一试管内。 在该细胞收集管内加入生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混 匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉 淀细胞充分摇匀，再用生理盐水离心洗涤1次。 用0.3ml生理盐水（约6滴）将沉淀细胞稀释，摇匀。 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分 混匀，用计数板在显微镜下计数，计算单个核细胞浓度 （个/ml）。 检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一 试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单 个核细胞中着色的死细胞数
1.提取淋巴细胞步骤
提取大鼠淋巴细胞的步骤：1.准备工作：将实验用具（小剪子3把，小镊子3把，磁盘1个，离心管1盒，离心管盖1盒，筛网1盒，表面皿1组，注射器2支，手套1副，1000ul枪头1盒，200ul枪头1盒，10ul枪头1盒，白大褂）放在紫外光下照射30分钟以上。
实验试剂（PBS、无血清的培养液、有血清的培养液、淋巴细胞分离液）准备好。
检查酒精灯内酒精量灯芯、酒精棉量。
脱颈处死，放入酒精中浸泡20分钟（可放到无菌室中）。
3.拿好实验药液（有血清的培养液，无血清的培养液，PBS，淋巴细胞分离液）进入无菌室，穿好白服套袖，于手上身上喷好酒精消毒，进入操作台，擦拭台子，台子干后点燃酒精灯。
（缓冲液，生化反应中以免影响体系PH值波动），将大鼠取出至于磁盘中，于腹中线剪开皮毛，向左侧剪开，用镊子在大鼠左侧找到长条状的脾脏，将脾脏至于PBS中分离结缔组织。
注意：勿将脾脏接触到皮毛引起污染，结缔组织尽量去除干净200目），浸湿，用镊子夹取脾脏至于筛网上，用第一个注射器芯将其碾碎干净（碾碎至筛网上剩余物质为白色），吸取无血清培养液2mlPBS的无用表面皿中。
注意：夹取脾脏的镊子不可以碰到筛网以外的液体中，以免污染组织；注入培养液时不要产生气泡（气泡会影响细胞生长）。
6.避光条件下，第二个注射器吸取3ml淋巴细胞分离液（先注入气体再抽取液体）加于离心管中（加4个）。
将装有组织液的表面皿倾用新的一二混用注射器吸取3ml缓慢注入离心管中，一定要让界面明显。
7.稳拿离心管放入离心机中，离心（2500r/min，20min）。
注意：动作稳，配平时找放的稳得离心管。
若脾脏的状态不好，可适当增加离心转数（3000）。
8.稳稳拿出离心管，用200ul 的枪吸取离心管中处于中间的淡黄色条带（先排气后插入吸取液体，一般能吸取500-600的液体），集中收于第五、六个离心管中，9.离心（1500r/min，10min），慢弃上清（倒入刚才的表面皿中），加入PBS 6-7ml反复吹吸充分，离心（1500r/min，10min）。
脾细胞提取实验报告
一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。
2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。
3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。
二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。
脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。
四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。
- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。
- 使用手术刀将脾脏从体内取出。
2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。
- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。
- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。
- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。
- 1000g离心5分钟，弃去上清液。
- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。
3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。
- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。
4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。
- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。
五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。
2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。
3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。
4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。
六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。
2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。
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2. 3.
平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹 力。 镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑 动。
参考文献：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 殷玉俊,等.[J]江苏大学学报医学版,2008,18(1):15-18 泰淑红,等.[J]免疫学杂志,2008,24(1):34-37 Juntao Zou, et,al.[J]Journal of the Neurological Sciences,2008,5:003-007 朱 鹏,等.[J]中华微生物学和免疫学杂志,2007,27(11):1046-1049 朱 鹏,等.[J]世界华人消化杂志,2007,15(31):3289-3294 刘 义,等.[J]生殖与避孕,2007,27(11):691-694 张 慧,等.[J]江苏大学学报医学版,2007,13(2):97-101 王晓莲,等.[J]实用老年医学,2007,21(4):240-242
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小鼠淋巴细胞分离
小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。
4)500g，5min，弃上清。
5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。
7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。
小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。
.2)500g，3min，弃上清。
3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。
加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。
小鼠淋巴细胞的分离培养
小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。
3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。
4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。
二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。
2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。
离心。
3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。
4加入1640培养液进行培养。
、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。
淋巴细胞分离的实验方法
肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。
2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。
3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。
4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。
5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。
6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。
7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。
2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。
4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。
5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。
2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。
2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
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从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。