MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)
MTT的测定方法基本上是利用细胞本身的酵素对受质的作用
MTT的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。
如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。
利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意。
细胞增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)[3]：选择对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化5～8min，调整细胞浓度为5×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，再分别加入不同浓度药物（1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL），并设置培养液对照。
置37℃，体积分数为5％CO2条件下培养56～72h，于结束前4h加入MTT10μL/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μL/孔，振荡10min左右，置酶标仪测A值，波长为570nm。
用含15％小牛血清的1640培养液将801-D细胞或肿瘤细胞接种于96孔板，每孔100?μl，设空白组及不同肿瘤细胞浓度组，每组分别设为5×102、1×103、5×103、1×104、2×104、5×104／孔。
置37℃、5％CO2饱和湿度培养72小时，弃上清。
每孔加MTT 20?μl(浓度5?mg ／ml)，继续培养4小时。
加100?μl DMSO，平板振荡器上震荡5分钟，在酶标仪上以570?nm 波长检测。
脾T淋巴细胞增殖反应测定[4]脾细胞（2.5×105/孔）在37℃，5% CO2培养条件下，用10ug/ml gD蛋白（阴性对照组为RPMI1640培养基；阳性对照组为5ug/ml PHA）刺激3天。
加入10ul MTT(5m g/ml)，37℃继续培养4小时后，每孔加入100ul DMSO溶解formazon。
检测各孔490nm光吸收值（每一组设3个重复孔）；计算刺激指数（SI）=A490nm(实验组)/A490nm(阴性对照组)。
MTT法检测细胞活力精讲
耐药性机制研究
通过MTT法可以研究肿瘤 耐药性的机制，了解耐药 相关基因和蛋白的表达及 功能。
逆转耐药性
MTT法可用于筛选能够逆 转肿瘤耐药性的药物或分 子，提高肿瘤治疗的疗效。
注意事项与局限性
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实验条件控制
细胞状态与培养时间
干扰因素
仅适用于贴壁细胞
MTT法的实验条件需严格控制 ，以确保实验结果的准确性和 可靠性。
细胞类型特异性
MTT法在不同类型的细胞 中表现出不同的敏感性， 可用于研究不同细胞类型 的毒性特征。
细胞凋亡检测
通过MTT法可以检测细胞 凋亡的发生，了解凋亡相 关基因和信号通路的活性。
在肿瘤耐药性研究中的应用
肿瘤耐药性评估
MTT法可用于评估肿瘤细 胞对化疗药物的耐药性， 为制定有效的治疗方案提 供依据。
通过MTT法可以研究药物的作用机制， 了解药物对细胞生长、增殖和凋亡等 方面的影响。
药物浓度与细胞毒性关系
通过MTT法可以观察不同浓度的药物 对细胞活力的影响，从而确定药物的 毒性阈值和安全使用范围。
在细胞毒性研究中的应用
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细胞毒性评估
MTT法可用于评估不同因 素对细胞造成的毒性作用， 如化学物质、辐射、病毒 等。
80%
细胞毒性评估
通过比较给药组与对照组的OD值 ，可评估药物的细胞毒性。OD值 降低表明药物对细胞活力产生负 面影响。
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mtt法的操作步骤
细胞培养与样品准备
细胞培养
选择适宜的细胞系，在适宜的培 养条件下进行细胞培养，确保细 胞生长旺盛、状态良好。
样品准备
将待检测的细胞样品离心，去除 培养液，并用磷酸盐缓冲液清洗 细胞，去除残留的培养液。
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
MTT实验方法步骤
一．悬浮细胞MTT实验时,由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失,而且操作又麻烦.请教各位老师,不用弃上清的SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢!1．介绍一种巨噬细胞杀伤活性的MTT检测：于24孔培养板中加入1×109/L腹腔巨噬细胞(1ml/孔)，培养2h后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的MDP。
收集对数生长期的UMR106细胞，调整细胞浓度至1×108/L，加入各孔，效靶比（E/T）为10:1，再培养24h，充分振荡。
每孔取100μl的UMR106细胞移入96孔培养板，各孔加入5g/LMTT20μl，培养4h，再加入10％SDS100μl，测定570nm处的A值。
计算公式如下：杀伤活性（％）=(1－实验组UMR106细胞的A值/对照组UMR106细胞的A值)×100％本方法参考文献，Jiao H, Shan WM, Ohe Y, et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother,1992;35:412～4162．SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm 波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。
SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。
除此之外SRB法还有以下优点：(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。
(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。
（3）可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT 法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。
T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴增殖实验:第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀;(2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀;⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次;(4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min;(5)悬于1mL DMEM 中;(6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的ConA,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d;(7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。
取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。
2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50µl含20µg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告本实验旨在探究淋巴细胞的转化过程及其影响因素。
实验过程中，将淋巴细胞与一种称为“共同诱导剂”的物质一起培养，观察其细胞增殖情况，并对其进行形态、生物学指标等方面的分析。
实验设备：1.淋巴细胞分离液2.共同诱导剂3.2.5％DMSO4.96孔板5.无菌蒸馏水6.比色计7.显微镜实验步骤：1.将新鲜小鼠脾脏切割成碎片，加入10ml的淋巴细胞分离液中，用离心机将其离心5min，取上清液为淋巴细胞。
2.将淋巴细胞洗涤三次，倒掉上清并加入10ml新的淋巴细胞分离液进行离心。
重复该步骤3次，以去除悬浮在淋巴细胞上的血红细胞和血小板。
3.将10μl细胞悬液加入90μl试验液（不含共同诱导剂），分别加入5% DMSO，共同诱导剂和一个对照组，分别孵育24h，48h和72h。
4.将80μl的淋巴细胞悬液加入新的96孔板中。
根据实验要求进行加药与相应的控制。
5.将淋巴细胞36h悬液转移到新的96孔板中，各包含80μl，进行形态学观察。
6.将淋巴细胞72h转移，在比色计中检测细胞增殖情况，计算得到相应的增殖指数（SI）。
实验结果：1.形态观察通过显微镜观察淋巴细胞的形态学变化。
对照组：淋巴细胞间距等距，无细胞破裂或缺损。
5% DMSO：淋巴细胞受到较严重的损伤，细胞全部变形。
共同诱导剂：淋巴细胞形态多样性，出现组织块状聚集现象。
2.细胞增殖情况70h后，比色计检测增殖情况。
对照组：SI为15% DMSO：SI为0.4共同诱导剂（分析不同剂量）：(a) 0.01ug/ml：SI为1.8(b) 0.1ug/ml：SI为2.7(c) 1.0ug/ml：SI为2.1实验分析：淋巴细胞转化是一种细胞增殖的过程，在此过程中细胞数量增加。
转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
体外诱导转化中，加入化合物或病毒等诱导剂，以刺激细胞增殖。
本实验中，采用的淋巴细胞采用体外诱导转化的形式。
实验结果表明，共同诱导剂对淋巴细胞转化具有明显的促进作用，而DMSO对淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用。
(methyl thiazolyl tetrazolium) mtt法
(methyl thiazolyl tetrazolium) mtt法1. 引言1.1 概述MTT法是一种常用的细胞存活率检测方法，它通过检测细胞对(methyl thiazolyl tetrazolium) MTT染料的代谢能力来评估细胞的生命活力。
该方法被广泛应用于生物医学研究中，特别是在肿瘤细胞耐药性研究、药物筛选与毒性评价以及组织工程等领域。
1.2 文章结构本文将首先介绍MTT法的基本原理和在细胞存活率检测中的应用，然后详细阐述MTT法的操作步骤，包括细胞处理及培养条件准备、MTT染色和测量以及数据分析和结果解读。
接下来，本文将分享一些MTT法在生物医学研究中的应用案例，包括肿瘤细胞耐药性研究、药物筛选与毒性评价以及组织工程及再生医学。
最后，文章将总结并展望MTT法在未来的发展前景。
1.3 目的本文旨在全面介绍MTT法，并突出其在生物医学研究中的重要应用。
通过详细阐述MTT法的原理、操作步骤和应用案例，旨在提供读者对该方法的全面了解和应用指导，进一步促进其在生物医学研究中的广泛应用和发展。
同时，本文也希望能够引起更多研究者对MTT法的关注，并为未来的相关研究提供新思路和启示。
2. MTT法的原理：MTT法（(methyl thiazolyl tetrazolium) MTT assay）是一种常用的细胞存活率检测方法，通过测量细胞内还原酶催化将无色MTT显色成紫色形azán离子。
该方法基于细胞代谢活跃度与存活能力密切相关的原理。
2.1 MTT法的基本原理：MTT是一种黄色可溶于生理盐水的四唑类化合物，在细胞实验中被广泛应用。
当MTT进入到细胞内后，由于存在细胞内还原酶（如线粒体呼吸链中的NADH-脱氢酶、二氢四氮杂苯脱氢酶等），MTT会被代谢成可以溶于有机溶剂（如DMSO，二甲基亚砜）的紫色产物——甲基三唑瓣啉蓝(MTT-formazan)。
这个过程为混色反应。
2.2 MTT法在细胞存活率检测中的应用：MTT法主要通过检测MTO-formazan所生成的紫色产物来分析细胞存活率和生长情况。
T淋巴细胞转化实验 ppt课件
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖， 其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲 基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催 化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异 丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞 增殖活化的程度呈正相关。
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试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。
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试剂与器材
3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高
压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。
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操作步骤
外周血0.2ml
PHA
无PHA
5%CO2 37℃ 72h 1500rpm 离心10min
吸取白细胞层涂片ppt课件24 2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类检查推片头、体、尾三部 分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及 成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞， 按下列公式计算转化率：
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转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细
胞数
100%
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四、结果观察
可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为 6 -8
um ，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱 性。
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淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(2) 淋巴母细胞：
细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态不整齐，常有小突出，核 质染色疏松，有核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。
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MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验
1.实验步骤：
1.1.调整淋巴细胞浓度：
a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min；
b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将
脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研
钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料
离心管；
c)离心1500rpm, 5min；
d)用Hank’s液洗2次；
e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀
后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡；
f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。
（假定4个大方格内总数为N，则
该细胞悬液的浓度为n=105*N）
1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。
以
100μl/孔加入96孔细胞培养板中。
（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。
）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。
不同品种的动物也有一定的不同。
1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防
止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。
细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。
1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。
每过24小时需取
出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。
1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。
1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去
细胞培养液，纸巾吸干。
加入DMSO，150ul/孔。
充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解）
1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
2.实验仪器和材料：
2.1超净工作台（用前紫外灯照15-25min），酒精灯，酒精棉球；
2.2烧杯（250ml，用来盛放小鼠），酒精75%，2个
2.3培养液瓶（100ml），5个
2.410ml移液管或小量筒（50 ml），2个
2.51640培养液，胎牛血清，庆大霉素；
2.6小平皿（若干），剪刀，镊子，
2.7Hank’s液，1ml注射器，200目铜网；
2.810ml塑料离心管，离心机，胶头滴管；血球计数器，盖玻片，冰醋酸染液，
显微镜；
2.9刺激物Con-A、PHA（T细胞）和LPS（B细胞）；
2.1096孔培养板；50ul，200ul，1ml吸头和相应量程的可调移液器；
2.11CO2培养箱，倒置显微镜；
2.12MTT，0.22微孔滤器；离心机（可用于96孔板离心），异丙醇，盐酸，酶
标仪。
3.试剂配备
3.1培养液在1640培养液中加入10%小牛血清、庆大霉素（终浓度30ug/ml）。
（小牛血清融化后，离心1500rpm, 5min，以便除去热灭活后形成的沉淀）培养液配好后，放4℃保存（拧紧瓶盖，否则CO2逸出，PH升高，颜色变紫）。
3.21.5%冰醋酸
4.2ml 36%冰醋酸，加入9
5.8ml超纯水，放于4℃保存。
3.3MTT 用培养液稀释至2mg/ml，充分溶解后，过0.22微孔滤膜。
3.4酸性异丙醇96ml异丙醇,加入4ml 1M盐酸。
(1M盐酸称1g 36-38%盐酸
（0.1ml）,加生理盐水至10ml)。