小鼠脾脏中分离淋巴细胞之欧阳光明创编
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
正确抓取小鼠并处死
颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉 ，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶
液中浸泡3-5min； 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交
界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪 及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包 括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细 胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的 Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密 度梯度离心时,•各种血液成分将按密度梯度重新分布聚 集。
当脾功能亢进时可破坏大量血小板及血细胞。脾有丰富 的血窦，可储存一定量（约200毫升）的血液，在机体 剧烈运动或爬山或突然失血时，脾的平滑肌收缩，放出 储存血液以补充机体的需要。
胸腺（thymus）
【CN110016462A】从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910125091.4(22)申请日 2019.02.20(71)申请人 优睿赛思（武汉）生物科技有限公司地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道666号生物创新园C6栋C6221室(72)发明人 娄阳 吴海 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所(普通合伙) 42212代理人 胡清堂(51)Int.Cl.C12N 5/0781(2010.01)(54)发明名称从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(57)摘要本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至30％。
所以，该方案不但能够极大程度缩短单克隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单克隆抗体的数量和多样性。
权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 110016462 A 2019.07.16C N 110016462A权 利 要 求 书1/1页CN 110016462 A1.一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，所述脾脏细胞为经过普通抗原免疫的脾脏细胞，其步骤如下：1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度；2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞；3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞；4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。
实验四脾淋巴细胞分离 邵(1)
活细胞 死细胞
自动化细胞计数器Luna™ 韩国Logos Biosystems公司
一块计数板/2组
在5×104 – 1×107 细胞/ml的浓度范围 3-60 µm的细胞直径范围内
注意事项
1. 通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细胞 作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
阴性实验结果的原因分析？
个性问题 抗原和抗体反放是否会出现结果？
判断抗原的阳性程度？
弧形沉淀及沉淀倾斜的原因分析？
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
2. 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
预实验结果
Control
50ul PBS+ 0.5ul Ab
50ul PBS+ 2ul Ab
APC-CD3 T cells
PE-CD19 B cells 分析数据时建议只放一组实验组，各人可自行安排
实验二报告分析
共性问题： 不能结合本组实验进行结果分析
MACS
➢ 磁性微珠是20世纪80年代初以高 分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离 子为核心、外层均匀地包裹高分 子聚合体的固相微粒。
➢ 以磁性微珠为载体，包被上针对 某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形 式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质 为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光 激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter, FACS）,是分离和鉴 定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
小鼠免疫器官的解剖实验报告
小鼠免疫器官的解剖实验报告一、实验目的1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。
2、学握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。
二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。
它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。
一般来讲，脾脏有三大功能：首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量；其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。
脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。
脾脏还有产生淋巴细胞的功能。
我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。
小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞是液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞是液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。
三、实验器材KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械四、实验步骤1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。
2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS冲洗，制得脾细胞是液。
3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。
4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、是浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1：1。
5、2000r/min离心30min。
6、小心吸取中间层细胞，1000r/min5min离心洗涤两次。
7、将制得的淋巴细胞滴于玻片，镜检。
小鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法比较
小鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法比较范尔钟;李颖;锡琳;欧阳昱晖;张罗【期刊名称】《中国耳鼻咽喉头颈外科》【年(卷),期】2010()10【摘要】在变应性鼻炎的基础研究中,探讨调节性T细胞（T regulatory cell,Treg 细胞）中转录因子FoxP3对细胞因子受体Ebi3表达调控的分子机制,是以小鼠脾脏淋巴细胞为研究对象,可以通过CD荧光抗体标记,免疫磁珠分选法或流式细胞分选法获得Treg细胞。
因此,建立有效的小鼠脾脏淋巴细胞分离技术是至关重要的前期工作,是进行这些研究的先决条件。
本文采用了两种方法对小鼠脾脏Treg细胞进行分离,并对脾脏Treg细胞活性与获得率进行了比对分析。
【总页数】3页(P550-552)【关键词】T淋巴细胞,调节性;细胞分离;鼻炎,变应性,常年性;小鼠【作者】范尔钟;李颖;锡琳;欧阳昱晖;张罗【作者单位】北京市耳鼻咽喉科研究所;首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科;耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)【正文语种】中文【中图分类】R735.704【相关文献】1.免疫磁珠两步法体外分离纯化小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞的应用研究[J], 黄克力;王巍;谢波;朱平;卢聪;朱小兰;麦明杰;沈二霞;吴若彬;刘怀普;黄晶晶2.流产模型孕鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法的初步建立 [J], 殷治华;赵富玺;穆雅琴;刘润花;王健;冯婷婷;齐彦3.免疫磁珠负性分离纯化小鼠脾脏CD8^+ T细胞 [J], 杨曌;傅晓岚;尚小云;吴玉章;赵建平;王莉4.小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞纯化方法的比较 [J], 陈蓉明;郑秋红;龚福生;应敏刚;谢云青5.不同分离方法对小鼠脾脏调节性T细胞表达特征的影响 [J], 李颖;欧阳昱晖;范尔钟;锡琳;张罗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较
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从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
欧阳光明（2021.03.07）
１小鼠断颈处死，酒精浸泡５分钟，超净台内打开左侧腹部皮肤，小心分离皮下组织和腹部肌肉暴露出脾脏，提起，剪去周围结缔组织，放入有PBS的小瓶中。
无菌镊子夹碎，挤压脾脏，将获得的细胞悬液移入无菌试管中。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。
个人用1500转/分钟，20分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟，10分钟）。
４，洗好的细胞加入１６４０培养液和２０％的血清中重悬，缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中，封好，放３７度孵育一小时。
一小时后取出，超净台内将柱子立起，针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号注射器做的），以HANKS液和血清先后缓慢冲洗，巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来，B细胞也相对吸附冲洗下来的不多，所以冲洗来的大多是T细胞，纯度可打到８０％到９０％，再次冲洗并且用力挤压，这样得到的就是B细胞。
得到的细胞可以以１６４０加血清配制的培养液进一步培养或做它
用。
但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分，如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。