报告实验二：淋巴细胞分离实验.ppt
淋巴细胞实验报告
1. 了解淋巴细胞转化实验的基本原理和方法。
2. 掌握淋巴细胞转化实验的操作步骤。
3. 分析实验结果，探讨不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响。
二、实验原理淋巴细胞转化实验是一种常用的细胞学实验方法，用于研究淋巴细胞的活性和功能。
在实验过程中，淋巴细胞受到有丝分裂原或抗原刺激后，会发生增殖和转化，从而增加细胞数量。
根据转化过程的不同，可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
本实验采用体外诱导转化方法，通过加入化合物或病毒等诱导剂刺激淋巴细胞，观察细胞转化情况。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 人外周血- RPMI-1640培养液- 细胞分离液- 淋巴细胞刺激剂（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）- 台盼蓝染色剂- 流式细胞仪- 显微镜2. 实验仪器：- 移液器- 培养箱- 恒温水浴箱- 染色缸- 计数板1. 淋巴细胞分离：采集人外周血，用细胞分离液进行分层，收集淋巴细胞。
2. 细胞培养：将分离的淋巴细胞用RPMI-1640培养液稀释，接种于培养皿中，置于培养箱中培养。
3. 淋巴细胞转化：向培养皿中加入淋巴细胞刺激剂，培养一段时间后，收集细胞。
4. 细胞染色：将收集的细胞用台盼蓝染色，显微镜下观察细胞形态。
5. 流式细胞仪检测：将染色的细胞用流式细胞仪检测，分析细胞转化率。
五、实验结果与分析1. 细胞形态观察：显微镜下可见，未经刺激的淋巴细胞体积较小，呈圆形或椭圆形；经过刺激的淋巴细胞体积增大，呈多边形或不规则形。
2. 流式细胞仪检测：经过刺激的淋巴细胞转化率为60%，未经刺激的淋巴细胞转化率为20%。
3. 不同刺激条件对淋巴细胞转化能力的影响：- 植物血凝素（PHA）刺激：淋巴细胞转化率为70%。
- 刀豆蛋白A（ConA）刺激：淋巴细胞转化率为65%。
- 无刺激：淋巴细胞转化率为20%。
六、实验结论本实验通过淋巴细胞转化实验，观察到淋巴细胞在受到刺激后发生转化，转化率随刺激剂的不同而有所差异。
结果表明，植物血凝素和刀豆蛋白A对淋巴细胞转化能力具有显著的促进作用。
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告
小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告一、实验目的1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础二、实验材料1.淋巴细胞分离液2.EDTA抗凝剂常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固3.PBS缓冲液PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用4.戊巴比妥钠溶液作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。
用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。
5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml）三、实验原理外周血中各种细胞的密度不同。
密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。
第一层为血浆层。
第二层为环状乳白色淋巴细胞层。
第三层为透明分离液层。
第四层为红细胞层图1 小鼠外周血离心前后示意图四、实验步骤1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1)4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min7.弃上清液，加入4mlPBS待用图2 第一次离心后图片五、注意事项1.EDTA和淋巴细胞分离液使用前应预温至22℃2.在淋巴细胞分离过程中，应控制室温在22~25℃，过低或过高应延长或缩短离心时间六、实验思考第一次分离后淋巴细胞层存在红细胞，应该是抗凝剂储存时间久导致血液抗凝补充分的缘故。
淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成实验 ppt课件
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肝素抗凝全血+等量Hanks液
将F/H管稍倾斜
将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上 面。
应注意保持两界面清晰，勿使血 液混入分层液内。
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min 水平离心
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血小板
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用 毛 细 吸 管 轻 轻 插 入 灰 白 色 层 ， 沿 管 壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另 一支离心管中。
T淋巴细胞玫瑰花环p扫pt课描件 电镜，6500×
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实验步骤
1.取1ml豚鼠肝素抗凝血于试管中，加等量Hanks液稀 释，手动轻轻摇匀；
2.取2ml淋巴细胞分离液加入15 ml离心管中；
3.用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢 加入，注意保持两种液体界面清晰
4.室温下立即置水平式离心机以2000rpm 离心20分钟， 离心后分为4层。
SRBC受体
SRBC
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实验器材
注射器、刻度吸管、毛细吸管、玻片、试 管、离心管
肝素、无Ca、Mg的Hanks液、淋巴细胞分离 液、双蒸水、生理盐水、 0.8%戊二醛、瑞 氏染液
家兔红细胞悬液 、豚鼠淋巴细胞、灭活小 牛血清
离心机、水浴箱、显微镜等。
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实验方案
30-45min
加1小滴瑞士染色剂，轻轻混匀
5min
取1滴于玻片上，加上盖玻片
高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞
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结果判断
凡能结合三个以上绵羊红细胞者为 玫瑰花形成阳性细胞。 正常人的花环形成率50-70%，大致可 以代表周围血中T细胞的百分数。
淋巴细胞分离液
二、巨噬细胞吞噬功能测定
实验目的
熟悉小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法。 了解巨噬细胞吞噬作用的原理和检测方法。
试剂:
1．淋巴细胞分离液（比重1.0770.001）。 2．肝素溶液 用生理盐水配制成500U/ml。 3．Hanks液。 4．2g/L台盼蓝染液。 5．标本 肝素抗凝的人外周静脉血。 6. 白细胞稀释液。
实验方法
1．室温下，将2ml抗凝血与2ml Hanks液混合
抗凝全血 缓冲液
实验方法
2．取分离液2ml置入灭菌离心管内，用毛细 吸管将稀释血液4ml沿管壁加入离心管，使 稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分离液 与稀释血液体积比例为1：2）。
定时间内来不及测定，可将未加盐酸异丙醇的培 养板置4C保存。测定前取出，室温静置10min 后再加盐酸异丙醇。
实验讨论
1. 试讨论MTT比色法检测淋巴细胞转化的优缺点？ 2. MTT比色法容易因细菌污染导致实验失败，应采取
哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
福建医科大学 陈敏
实验三 细胞吞噬率与 吞噬指数测定
实验原理
T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细 胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应， 如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和 核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液。 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌3% NaHCO3调pH至7.2～7.4。 2. 植物血凝素（PHA）。
吸取白细胞层涂片 染色镜检观察细胞形态
操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500g/ml ) 0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混匀后置37C、 5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一 次。
淋巴细胞分离的实验方法
肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。
2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。
3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。
4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。
5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。
6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。
7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。
2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。
4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。
5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。
2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。
淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。
2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告
小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。
为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。
本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。
二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。
2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。
3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。
ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。
B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。
ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。
iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。
C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。
ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。
iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。
iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。
D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。
ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。
三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。
2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。
3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。
四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。
然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。
可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。
2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。
免疫学实验报告
实验报告一姓名：陈羽迪班级：12生物制药（1）学号：2012332870002一、实验目的1.熟悉人外周血淋巴细胞的组成2.熟悉人外周血淋巴细胞分离的方法3.熟悉密度梯度离心法分离淋巴细胞的原理和方法二、方法步骤、观察内容1、采静脉血2ml加入抗凝管，轻轻摇动试管，混匀，5min后加入Hank's 液2ml，手动轻轻摇匀。
2、将抗凝血全部沿管壁缓慢加至另一含2ml淋巴细胞分离液管的液面上，注意保持两种液体界面清晰。
3、将试管平衡后置水平式离心机，1000rpm离心20min。
4、用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内。
5、加入5倍体积的Hank's液，手动旋转试管使液体混匀，1000rpm离心10min，弃上清，沉淀即主要为淋巴细胞（或单位个核细胞）。
加入含10%灭活小牛血清Hank’s液1 ml，混匀后进行计数。
（备注：如做淋巴细胞转化或其它培养，所用试剂、器材应是无菌的。
）6.细胞存活率检测：取10ul淋巴细胞悬液加入0.4%台昐蓝染色液10ul，混匀。
取10ul加入血细胞计数板，精制片刻，置显微镜高倍镜下观察。
三、观察结果离心后分为四层。
血浆层为黄色，淋巴细胞层为白色。
分离液层为浅黄色红细胞层为红色。
结果计算：四个大方格中淋巴细胞总数为339单个核细胞总数=339/4×5（稀释倍数）×1×10^4=4.24×10^6 细胞存活率=226/(226+10)=95.8%四、分析讨论1. 人外周血中的淋巴细胞组成？T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞2.根据细胞的表面标志分离淋巴细胞的原理是什么？不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同。
具体如下图：实验报告二姓名：陈羽迪班级：12生物制药（1）学号：2012332870002实验二：_E-玫瑰花环形成实验_一、实验目的1.掌握人T淋巴细胞形成E-花环的实验原理和操作方法。
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实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清
6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数
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注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
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细胞计数
实验步骤 注意事项
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
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原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
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实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
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实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
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原理
外周血
红细胞
1.093
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
淋巴细胞 单核细胞
1.092 1.075~1.090
1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
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稀
释
外
周
血
1500rpm,
20℃ , 30min
Ficoll
Ficoll
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稀释的血浆、 血小板 PBMC
红细胞 粒细胞
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实验步骤
1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨 （研磨同时滴加1640培养液，保持细 胞活性）
2. 细胞混合液静置数分钟后吸管吸取， 沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层 液上方（Ficoll：血细胞=1：1）
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实验步骤
3.2000r/min，离心15min
4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移 入另一试管中
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注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀
释不当，需重新制备细胞悬液、计数
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试验报告要求
原理, 步骤, 结果, 讨论。