【CN110016462A】从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法【专利】
脾脏提取DNA与人类白细胞抗原配型实验方法★
脾脏提取DNA与人类白细胞抗原配型实验方法★李海滨;郭海鸽;蔡文娥;覃音红;孙煦勇【摘要】BACKGROUND: Whether human leukocyte antigen matching results are accurate or not may directly affect the pairing choice between the donors and recipients. Moreover, the quality of the matching samples may influence the pros and cons of the results. OBJECTIVE: To establish an experimental technology platform for DNA extraction from the spleen in human leukocyte antigen matching. METHODS: Lymphocytes were isolated and DNA was extracted from the spleen for the human leukocyte antigen matching, compared with DNA extracted from the whole blood which was normal peripheral blood or hematolytic sample. RESULTS AND CONCLUSION: Intact electrophoretogram of DNA extracted from the spleen and normal peripheral blood was obtained after amplification and electrophoresis, and the electrophoretogram of DNA extracted from spleen was clearer than that extracted from the normal peripheral blood. However, the intact electrophoretogram of DNA extracted from hematolytic sample was not obtained. An experimental technology platform for DNA extraction from the spleen in human leukocyte antigen matching has been successful y established.% 背景：人类白细胞抗原配型结果报告准确与否，直接影响供受者之间的配对选择，而配型样本的好坏则影响结果的优劣。
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
脾脏淋巴细胞分离方法
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。
（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。
脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。
人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
免疫细胞的分离及检测课件
免疫磁珠分离法
6
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
7
（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
8
Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理:
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
34
淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
35
形态学检查法
36
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
37
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
1
免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
临床检验免疫主管 (14)
临床检验免疫主管 (14)临床医学检验主管技师考试辅导《临床免疫学和免疫检验》第四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术第一节免疫细胞的分离第二节淋巴细胞标志及亚群分类第三节其他的免疫细胞第四节免疫细胞表面标志的检测及应用第一节免疫细胞的分离一.外周血单个核细胞的分离将2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液与1份34%泛影葡胺生理盐水溶液混合，其比重为1.077±0.002，可作为常规的淋巴细胞分离液，即Ficoll分离液。
主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层.单个核细胞层.粒细胞层和红细胞层。
二.淋巴细胞的分离纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2＋存在时，能主动黏附在玻璃.塑料.尼龙毛.棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
1.黏附贴壁法2.吸附柱过滤法3.磁铁吸引法4.Percoll分离液法三.T细胞和B细胞的分离1.E花环沉降法2.尼龙毛柱分离法四.T细胞亚群的分离1.亲和板结合分离法2.磁性微球分离法3.荧光激活细胞分离仪分离法五.分离细胞的保存1.短期保存技术将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks.Tc-199.RPMI1640或其他培养液稀释重悬。
短期保存可置于4℃保存。
2.长期保存技术液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。
六.分离细胞的活力测定活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。
这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。
七.不同细胞分离方法的综合评价早期的免疫细胞分离技术主要是根据不同免疫细胞的物理属性（如比重不同）和生物学属性（如黏附力不同）进行分离，用目前的标准看，其分离的灵敏度或分辨率都不高。
实验二：淋巴细胞分离实验
4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移 入另一试管中
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实验步骤
5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清
6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数
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注意事项
1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面
2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
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实验步骤
5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
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注意事项
1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带
气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀
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细胞计数
实验步骤 注意事项
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实验步骤
1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞
悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许
细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
目的 原理 实验步骤 注意事项
精选2021版课件2 Nhomakorabea 目的熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
精选2021版课件
3
原理
脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
(完整word)脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1。
熟悉细胞分离的基本原理2。
掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3。
掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞,胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官.人的脾脏位于左季肋区的后外侧部,呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0。
2%台盼蓝染液8。
显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死-—用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织.（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中;2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上）4.取100uL至EP管中,进行计数和活力测定（建议5倍稀释)5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910125091.4
(22)申请日 2019.02.20
(71)申请人 优睿赛思（武汉）生物科技有限公司
地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高
新大道666号生物创新园C6栋C6221室
(72)发明人 娄阳 吴海
(74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所
(普通合伙) 42212
代理人 胡清堂
(51)Int.Cl.
C12N 5/0781(2010.01)
(54)发明名称
从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋
巴细胞的方法
(57)摘要
本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离
单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用
采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以
及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用
荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而
实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速
筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的
阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至
30％。
所以，该方案不但能够极大程度缩短单克
隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单
克隆抗体的数量和多样性。
权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 110016462 A 2019.07.16
C N 110016462
A
权 利 要 求 书1/1页CN 110016462 A
1.一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，所述脾脏细胞为经过普通抗原免疫的脾脏细胞，其步骤如下：
1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度；
2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞；
3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞；
4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。
其中，所述预标记筛选抗原为与小分子荧光染料偶联的普通抗原。
2.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原为与包含亲和素的小分子荧光染料偶联且经生物素标记的普通抗原。
3.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法包括以下步骤：采用滴加方式进行偶联反应，分多次将包含亲和素的小分子荧光染料滴加到经生物素标记普通抗原中进行偶联，每次滴加后孵育使其偶联充分；其中包含亲和素的小分子荧光染料的用量为经生物素标记普通抗原的5倍以上。
4.根据权利要求2或3所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述预标记筛选抗原的制备方法还包括以下步骤：在包含亲和素的小分子荧光染料和经生物素标记普通抗原偶联完成后，根据偶联产物的大小，选择合适的分子筛离心管，除去未偶联的底物。
5.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)为：以生物素标记的CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体和CD14单克隆抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除T淋巴细胞和单核细胞得到CD4、CD8和CD14阴性的脾脏细胞，提高B淋巴细胞的相对丰度。
6.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中荧光标记的IgM多克隆抗体为FITC标记的IgM多克隆抗体。
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