脾脏流式细胞术
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
B细胞表面标志
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 MACS
2. 根据细胞理化性质 ： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 ， B1 细 胞 为 CD19 和 CD5 双 阳 性 ， 而 B2 细 胞 仅 为 CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
脾
脾（spleen ）位于腹腔的左上方，是机体内最大的淋 巴器官，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆。
脾脏功能
脾在正常情况下，只产生淋巴细胞及单核细胞，但在病 态及大失血后可产生各种血细胞。脾主要功能是参与免 疫反应，脾内的巨噬细胞能吞噬和清除衰老的红细胞， 细菌和异物，产生淋巴细胞，及单核细胞，贮存血液。 胚胎时期可造血。脾脏在胚胎时期是一个重要的造血器 官，出生后能产生淋巴细胞和单核细胞。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法[发明专利]
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321625.1(22)申请日 2017.05.09(71)申请人 成都扬克斯生物科技有限公司地址 610094 四川省成都市高新区益州大道中段722号4栋14楼1404号(72)发明人 彭西 于正强 胡东 李林蔚 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)(54)发明名称小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；分别吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。
本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。
权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 107132177 A 2017.09.05C N 107132177A1.一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；步骤2，吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入两支流式上机管中一支管中加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一支用作阴性设置管；步骤3，染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；步骤4，分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。
实验四脾淋巴细胞分离及流式检测 邵
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可重复滤过
超净台下操作全过程 4
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实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
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可重复滤过
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（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)(1)
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)
lived dead
实验材料：
小鼠 手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶 平皿，尼龙膜指套、研磨棒
PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）
细胞计数板 0.2%台盼蓝染液 显微镜（关掉之前，请把光度调到最小！！）
实验步骤
（一）取小鼠脾脏：
小鼠颈椎脱位处死（注意安全）； 用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮肤 暴露腹腔，再找到脾脏，劲量剪除脾脏周围组织；
• • • •
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
注意： 细胞总数和细胞活力可以一起做 细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数 细胞活力=活细胞数/总数x100%
1.颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住 鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离 2.摘取脾脏：用75%酒精喷小鼠腹部，使其皮毛沾湿。用剪刀，剪开皮 肤暴露腹腔，再找到脾脏，尽量剪除脾脏周围组织 3.研磨脾脏：在培养皿中加入3mlPBS，将脾脏放入过滤网制成的指套中， 再放入培养皿中，用注射器的活塞棒或研棒将脾脏研碎。将含有脾脏细 胞的PBS移入15ml离心管。再取3mlPBS冲洗培养皿后移入15ml离心管。
（三）计算细胞浓度
将上述细胞悬液做一定倍数（10倍左右）的稀释（小鼠脾 脏细胞一般为1x107-2x108）； 混匀稀释后，取10uL加至细胞计数板中(不要有气泡），计 数细胞计数板中4大方格细胞总数； 计算细胞总数：
细胞浓度=4个大方格细胞总数/4*104*稀释倍数。
细胞总数=细胞浓度x细胞悬液的体积
《医疗器械免疫原性评价方法第6部分用流式细胞术测定
《医疗器械免疫原性评价方法第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群》标准编制说明一、工作简况1.任务来源根据2018年医疗器械标准制修订工作安排，由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口，山东省医疗器械产品质量检验中心、北京市医疗器械检验所负责制订YY1465.6《医疗器械免疫原性评价方法第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群》。
2.标准体系YY/T1465的总标题是医疗器械免疫原性评价方法，包括以下部分：—第1部分：体外T淋巴细胞转化试验；—第2部分：血清免疫球蛋白和补体成分测定ELISA法；—第3部分：空斑形成细胞测定琼脂固相法；—第4部分：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验半体内法；—第5部分：用M86单克隆抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率；—第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群。
有关其他方面的免疫原性试验将有其他部分的标准。
3.工作过程在接到标准制定任务后，标准起草工作组认真研究，于2018年3月召开首次视频工作组会议，召集共同验证单位确定工作组讨论稿和标准验证方案。
在分析验证结果和对标准内容进行充分讨论后,工作组于7月底完成并发出征求意见稿。
二、标准编制原则和确定标准主要内容的论据。
标准修订工作组按照GB/T1.1—2009的规则制定本部分。
1、医疗器械中免疫原的来源免疫原即医疗器械中所含有的，可以刺激机体发生免疫应答的异源性物质。
蛋白质作为免疫原性物质的可能性最大，其次是多糖，核酸和脂质等。
小分子量的物质通常没有免疫原性，然而，它们可以通过与宿主蛋白结合并改变蛋白的构象来获得免疫原性。
对于医疗器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金属材料可能具有的溶出物、磨损或可降解部分能够与宿主蛋白结合。
生物源性的材料，如胶原，天然乳胶蛋白，白蛋白和动物组织等都可以刺激机体发生免疫应答。
2、国际上对医疗器械免疫毒性评价的要求医疗器械中所含的免疫原性物质是导致其免疫毒性的原因。
小鼠脾细胞流式实验步骤_概述说明以及解释
小鼠脾细胞流式实验步骤概述说明以及解释引言部分的内容应包括概述、文章结构和目的。
1. 引言1.1 概述：本文旨在介绍小鼠脾组织中的细胞流式实验步骤。
流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，它能够对单个细胞进行高通量分析，并且在分析多个参数时提供了准确性和高度灵活性。
通过对小鼠脾细胞进行流式实验，我们可以深入了解该组织内不同类型细胞的数量、表型和功能，从而为进一步的研究提供重要依据。
1.2 文章结构：本文分为四个主要部分：引言、小鼠脾细胞流式实验步骤概述、正文和结论。
在引言部分，我们将简要概述本文要讨论的主题，并介绍文章结构；然后，在小鼠脾细胞流式实验步骤概述部分，我们将详细介绍研究对象的相关信息，并解释流式细胞术的基本概念；接下来，在正文部分，我们将重点讨论关于细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法的内容；最后，在结论部分，我们将总结实验结果和发现，并对其意义、局限性以及下一步研究提出展望和建议。
1.3 目的：本文的目的是向读者全面介绍小鼠脾细胞流式实验步骤。
通过详细阐述实验设计、样本制备、细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法，我们希望读者能够理解并掌握小鼠脾细胞流式实验的基本原理和操作技巧。
同时，通过讨论实验结果与发现的总结、结果意义与局限性的讨论以及对下一步研究的展望和建议，我们希望启发读者思考关于小鼠脾组织中特定类型细胞功能和相互作用机制方面的问题，为相关领域的深入研究提供思路和指导。
2. 小鼠脾细胞流式实验步骤概述：2.1 研究对象介绍：小鼠脾细胞是指从小鼠脾脏中分离出的细胞群体。
小鼠脾脏是淋巴系统的重要器官之一，其中包含各种免疫细胞，如B细胞、T细胞、巨噬细胞等。
小鼠脾细胞流式实验通过对这些免疫细胞进行标记和分析，可以帮助我们了解免疫反应的机制以及疾病发生过程中免疫系统的变化。
2.2 流式细胞术概念解释：流式细胞术（flow cytometry）是一种用于分析和计数单个活动或已死亡的细胞的技术。
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尼龙膜分离脾脏，5mlPBS重悬脾脏单个细胞+5ml淋巴细胞分离液，玻璃管中2000rpm 水平离心20min。
（其间只要接触到脾脏细胞的大枪头都不要换，可准备一个一次性手套，再利用的枪头可以打在里面）。
吸取中间细胞层于新玻璃管中，PBS洗2遍，1500rpm，5min。
用500ul 8%1640重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞数为相同浓度（5*106个/ml，即5*105 个/孔。
不得少于2-3*105 个/孔）铺96孔板。
每只老鼠的脾脏做3个孔重复，若做MTT，可加阴性对照，同样三个孔重复。
加入猪瘟病毒抗原（细胞毒或血毒都可）刺激，2ul血毒/孔，培养72h后吸取上清检测IL-4 和IFN-γ含量。
下层细胞可做MTT。
剩余的细胞，水平离心，弃去营养液，用PBS重悬后，加入三色抗体，孵育30Min 后，离心洗1-2次（看细胞数决定），底部细胞用1%胎牛血清的PBS重悬可以保存一夜。