流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中小鼠脾脏的摘取(图文解说)
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
正确抓取小鼠并处死
颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉 ，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶
液中浸泡3-5min； 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交
界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪 及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包 括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细 胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的 Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密 度梯度离心时,•各种血液成分将按密度梯度重新分布聚 集。
当脾功能亢进时可破坏大量血小板及血细胞。脾有丰富 的血窦，可储存一定量（约200毫升）的血液，在机体 剧烈运动或爬山或突然失血时，脾的平滑肌收缩，放出 储存血液以补充机体的需要。
胸腺（thymus）
脾切实验报告
一、实验目的1. 了解脾脏在免疫系统中的作用。
2. 掌握脾切除手术的操作步骤及注意事项。
3. 观察脾切除后动物生理变化，分析脾脏对机体的影响。
二、实验原理脾脏是人体最大的淋巴器官，具有过滤血液、清除病原体、产生抗体和调节免疫反应等作用。
脾切除实验可以模拟脾脏缺失的状态，研究脾脏在免疫系统中的作用。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：小白鼠2. 仪器：手术刀、手术剪、手术钳、镊子、剪刀、注射器、生理盐水、消毒液等3. 药品：肝素、抗生素等四、实验步骤1. 动物麻醉：使用肝素进行动物麻醉，确保实验过程安全。
2. 脾脏暴露：沿腹中线切开皮肤，暴露腹壁肌肉，分离肌肉组织，暴露腹腔。
3. 脾脏游离：用手术剪和手术钳分离脾脏周围组织，使脾脏与周围器官分离。
4. 脾脏切除：用手术剪将脾脏与脾蒂分离，用手术钳夹住脾蒂，切断脾蒂，取出脾脏。
5. 缝合创口：用生理盐水清洗创面，用消毒液消毒，用可吸收线缝合腹壁肌肉和皮肤。
6. 抗生素预防感染：术后给予抗生素预防感染。
五、实验观察与结果1. 术后观察：观察动物的精神状态、活动能力、饮食、呼吸等生理指标。
2. 实验结果分析：（1）术后初期，动物出现食欲不振、精神萎靡、活动能力下降等症状。
（2）术后第3天，动物开始恢复食欲，精神状态好转，活动能力逐渐恢复。
（3）实验过程中，未发现动物出现严重并发症。
六、实验讨论1. 脾脏在免疫系统中的作用：脾脏是人体最大的淋巴器官，具有过滤血液、清除病原体、产生抗体和调节免疫反应等作用。
脾切除实验表明，脾脏在机体免疫系统中具有重要作用。
2. 脾切除后的生理变化：脾切除后，动物出现食欲不振、精神萎靡、活动能力下降等症状。
这是因为脾脏在免疫系统中的作用减弱，导致机体免疫力下降。
3. 脾切除手术的注意事项：在进行脾切除手术时，应确保动物麻醉充分，避免手术过程中动物挣扎，造成手术风险。
同时，手术过程中应严格无菌操作，预防术后感染。
七、结论脾脏在人体免疫系统中具有重要作用。
实验二__小鼠脾细胞提取及计数
实验二小鼠脾细胞提取及计数一、介绍本次实验整体情况（8：00－8：05，5分钟）：本次实验的操作包括三部分：包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。
其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。
ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。
二、包被和封闭ELISA板：备注：提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8：05－8：15，10分钟)包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验（ELISA）做准备。
包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。
在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。
下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。
（1）包被ELISA板：1) 试剂和器材（老师已经在ELISA板上统一标记好）a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ;b. 绵羊红细胞抗原－SRBC;（a和b为包被液，实验室老师已经配好）c.聚乙烯塑料板，微量加样器2) 操作方法a. 包被液：碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗原SRBC；b. 聚乙烯塑料板：8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。
（2）微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下，老师教学生看量程):1) 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.5～20.0µl；P200： 20～200 µl； P1000：200～1000 µl）。
老师结合不同型号的微量加样器，指导如何读数，白色由左至右读数，黑/蓝色由上至下读数。
2)转动旋钮，调整量取体积。
顺时针旋转增加体积，逆时针减少体积。
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离
“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1. 培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2. 脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3. 无菌条件下将腹部剪开，脱皮。
(2min)
4. 选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5. 用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6. 脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。
(3min)
7. 离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml 离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。
(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8. 在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。
（6min）
9. 在显微镜下将细胞浓度调为5×106个/ml备用。
小鼠脾脏中分离淋巴细胞
从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。
实验四脾淋巴细胞分离及流式检测 邵
1 2 3
9
10
可重复滤过
超净台下操作全过程 4
5
8 6
7
实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
1
2
3
4
5
6
7
8
9
可重复滤过
10
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
脾脏流式细胞术
尼龙膜分离脾脏，5mlPBS重悬脾脏单个细胞+5ml淋巴细胞分离液，玻璃管中2000rpm 水平离心20min。
（其间只要接触到脾脏细胞的大枪头都不要换，可准备一个一次性手套，再利用的枪头可以打在里面）。
吸取中间细胞层于新玻璃管中，PBS洗2遍，1500rpm，5min。
用500ul 8%1640重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞数为相同浓度（5*106个/ml，即5*105 个/孔。
不得少于2-3*105 个/孔）铺96孔板。
每只老鼠的脾脏做3个孔重复，若做MTT，可加阴性对照，同样三个孔重复。
加入猪瘟病毒抗原（细胞毒或血毒都可）刺激，2ul血毒/孔，培养72h后吸取上清检测IL-4 和IFN-γ含量。
下层细胞可做MTT。
剩余的细胞，水平离心，弃去营养液，用PBS重悬后，加入三色抗体，孵育30Min 后，离心洗1-2次（看细胞数决定），底部细胞用1%胎牛血清的PBS重悬可以保存一夜。
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。
二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。
2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。
三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。
然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。
接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。
最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。
2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。
3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。
最后用显微镜观察并提取细胞。
四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。
经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。
五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。
2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。
3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。
4. 细胞处理过程中要避免污染。
六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。
这为后续的免疫学研究奠定了基础。
同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流式细胞分析和混合淋巴细胞反应实验中
小鼠脾脏的摘取
最近老婆要提取脾脏细胞做流式，我就做个简单的解说，也顺便传到网上供菜鸟理解，如果有大神看到这篇文章，也欢迎指导。
大家一起讨论，把实验做得更好。
无论是做混合淋巴细胞反应或者流式细胞分析都要用到脾脏。
小鼠的脾脏摘取颇为简单，但有很多同学是第一次接触，所以在此做一个简单的图文讲解。
在此讲解不甚详细，具体步骤请同学参照网上已有各种protocol,本文重点在于图文解说，让大家对照图片和其他protocol更好的理解脾脏的摘取。
一，小鼠处死后泡酒精2-3分钟，泡久了细胞会缩水，泡的时间短了起不到消毒杀菌的作用
二，摆好小鼠体位，取右侧卧位。
三，沿着小鼠左侧肋骨走行方向做切口。
准备眼科镊和眼科剪若干（文中笔者使用眼科直镊3把，眼科剪2把）
四，向小鼠左后背方探查，在皮下很浅的地方可见深红色脾脏。
脾脏走行向与肋骨方向近似平行
五，用镊子轻轻提起脾脏。
脾脏下会连着许多结缔组织，轻轻把它们撕掉。
六，完整摘下脾脏，放于培养皿中【事先在培养皿中放入PBS （混淋）或红裂（流式）和200目的铁丝网】如下右图所示，银色的为本步骤中使用的铁丝网，白色的为后面要用到的过滤膜
七，一把新的眼科剪和一把新的眼科镊（新消毒过的。
本文所用的为新高压的），把脾脏在培养皿里剪成小块。
然后用2.5ml或5ml注射器柄，把脾脏研磨成细胞。
研磨过程要轻柔，否则会损伤脾脏中的细胞。
八，研磨至培养皿中不见整块脾脏，只剩一些不能磨碎的结缔组织为止。
九，再加入4ml红细胞裂解液，冲洗铁丝网，注射器内芯，并用枪头吹打混匀，裂解5min 十，将液体一并转入15ml离心管中，400g,5min,离心
十一，弃去上清，加入5ml含10%FBS的1640 ,重悬, 用装有200目的尼龙滤膜过滤(可过滤两次); 尼龙滤膜就是第六步中右图的白色滤膜。
十二，滤液离心400g,5min,弃上清，加入1ml含10%FBS的1640,重悬混匀，稀释50(20+980)倍计数，；
至此，脾脏细胞就算提取完成了。
后面几步没有上图，但做过实验的同学很容易就能理解是怎么回事啦。