小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤
流式荧光染色法实验原理及步骤
流式荧光染色法实验原理及步骤原理：荧光染料CFSE，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。
当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。
这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
实验步骤，以小鼠脾细胞为例：1.取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中；2.在超净工作台上无菌取出小鼠脾脏；3.用无菌注射器内芯研磨脾脏，尽量不残留较大组织块；再用3mlPBS冲洗后，将脾脏研磨液经200目尼龙网过滤至15mL离心管中，离心350g，5min；4.弃上清后，加入2mL红细胞裂解液，轻微吹打，裂解2min后加入等体积PBS终止裂解反应，混匀后离心350g，5min；5.弃上清，用RPMI1640完全培养基重悬沉淀，并取10μL细胞液计数，将细胞浓度调至2.0×106/ml；6.提前将CFSE按照说明书用DMSO配成5mM母液，并分装储存于-80冰箱，其工作浓度为0.5-25μM；7、取部分细胞作为不染色组阴性对照，其他细胞加入CFSE溶液，使得终浓度为5μM，37°C避光孵育15min；8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培养液，4℃，5min以中止染色；9、弃上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培养液洗2次，最后用1640完全培养基重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞（阳性对照用PHA刺激）；10、37℃，5%CO2培养3天后用流式细胞仪分析细胞488nm激光器检查细胞增殖情况。
CFSE活染方法Protocol
制作细胞悬液，加入等体积 CFSE 工作液，于 37℃孵育 10 min，用 40%体积的冷 小牛血清立即终止标记 10min。 离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细 胞。
CFSE 的浓度国外报道从 0.5uM~20uM 都有，建议终浓度为 2.5-5uM。浓度太低， 细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时 要经常摇匀。
试剂盒成分
• CellTrace™ CFSE (Component A), 10 瓶，每瓶 50 μ g • DMSO (Component B), 0.5 mL
使用浓度：
一般来说，长时间染色（超过三天）或快速分裂为 5～10uM，活力分析等短时间分析为 0.5～ 5uM。 荧光显微镜为 25uM。优化并使用尽可能低的浓度以保持细胞的正常生理状态。
5. 37 ℃，避光放置 10min。
6. 250g 室温离心 10 分钟。弃上清，加入含 10%FBS 的完全 1640 培养液洗 2 次。 最后用 1ml R10 培养基（见附录 3）重悬。
7. 将上述细胞悬液加入 24 孔培养板,每孔 1mL,分别加相应的多肽库或者阳性 刺激物 SEB（Sigma, Cat# ）刺激 ,终浓度 1ug/ml
1．1
重悬细胞于预温的 PBS/0.1%BSA，浓度 1×10 6 /ml。
注意：为保证标记均匀，样本需为单细胞悬液。细胞浓度为 10 5 ~10 6 ,依标记后细胞的培养
时间而定。若需传代培养，浓度增加为 1～5×10 7。
1．2
每 ml 细胞中加入 2ul CFSE 贮存液，终浓度为 10uM。注意：最适工作浓度需优化，
二、CFSE 配制
用 DMSO 溶解成 5 mmol/L 的储存液，于- 20 ℃避光保存。使用时，用无血清 DMEM 培养液稀释成 5μ mol/L 的工作液备用。CFSE 试剂盒内有一小瓶 CFSE（A 试剂） 标明 500ug ，另有一小瓶 DMSO（B 试剂），500ugCFSE 溶解于 180ulDMSO 即是 5mMstock solution。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
B细胞表面标志
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 MACS
2. 根据细胞理化性质 ： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 ， B1 细 胞 为 CD19 和 CD5 双 阳 性 ， 而 B2 细 胞 仅 为 CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
脾
脾（spleen ）位于腹腔的左上方，是机体内最大的淋 巴器官，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆。
脾脏功能
脾在正常情况下，只产生淋巴细胞及单核细胞，但在病 态及大失血后可产生各种血细胞。脾主要功能是参与免 疫反应，脾内的巨噬细胞能吞噬和清除衰老的红细胞， 细菌和异物，产生淋巴细胞，及单核细胞，贮存血液。 胚胎时期可造血。脾脏在胚胎时期是一个重要的造血器 官，出生后能产生淋巴细胞和单核细胞。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
CFSE染色方法
细胞悬液置于离心管底部。
离心管横放，将PBS滴加在靠近管口的管壁上。
再将CFSE加在PBS滴上。
维持离心管横向水平，拧上管盖，迅速垂直倒置离心管于涡旋器上涡旋。
（可参考JOVE网上的CFSE标记视频）
步骤：
1. 常规方法分离PBMC，细胞计数后300g离心10分钟。
弃上清，加入1%FBS/PBS液体重悬，洗涤一次，再用合适体积数目的1%FBS/PBS重悬，取出2×10^6l的细胞悬液，离心弃上清。
2. 用0.1%FBS/PBS稀释CFSE储存液(5000×,5mM)至1umol/L。
3. 用0.5ml上述CFSE稀释液重悬细胞，轻柔混匀。
4. 37 ℃放置10min。
5. 加入1ml冰冷的RPMI 1640 完全培养液，4℃，5分钟以中止染色。
6. 300g室温离心5分钟。
弃上清，加入冰冷的含10%FBS 的完全1640培养液洗2次。
最后用0.4ml 培养基重悬。
7. 将上述细胞悬液加入96孔培养板,每孔105个细胞,（阳性对照用PHA刺激（1ug/ml））
8. 37 ℃, 5％CO2 避光培养3天。
9. 吸出培养液，24小时内上机检测。
（7AAD排除死细胞）
17. 在FACScalibur流式细胞仪上检测,用Cell Quest软件获取数据,然后用软件分析。
CFSE染色方法
CFSE染色方法CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）染色方法是一种常用的荧光染色技术，通过这种方法可以追踪和分析细胞的增殖、分裂和活性等生理过程。
该方法利用CFSE荧光染料的特点，通过与细胞内的酯酶作用而形成的CFSE标记，来实现细胞的可见光荧光示踪。
1.准备CFSE染料溶液。
通常使用的浓度为5-10μM的CFSE染料溶液。
可以将CFSE染料溶于合适的溶剂中，如无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）或DMSO（二甲基亚砜）等。
2.处理待染细胞。
将需要染色的细胞分离出来，通常采用离心法获取细胞沉淀物。
接下来，将细胞悬浮液转移到培养基中。
3.CFSE染料标记。
将CFSE染料溶液与待染细胞混合，使其浓度达到适当的标记浓度。
染色时间一般为10-30分钟，但是时间过长或过短都有可能影响染料的有效标记。
染色完毕后，可以通过加入等体积的培养基来停止反应。
4.清洗和处理标记细胞。
将染色细胞通过离心去除无效的染料溶液，然后用新鲜的培养基洗涤细胞，去除未结合的染料。
5.扩增和培养标记细胞。
将清洗干净的细胞转移到含有适当培养基、生长因子和补充物的培养皿中，进行培养和扩增。
6.荧光显微观察。
通过荧光显微镜观察染色细胞，使用合适的荧光滤镜来观察CFSE荧光的发射。
CFSE染色方法的优势是可以追踪不同细胞的活动和增殖过程，如细胞分裂、生长速度等。
此外，该方法简单、可靠、重复性好，并适用于各种类型的细胞。
通过CFSE染色可以实现对细胞的定量和定性分析，对研究细胞增殖、分化、迁移等生命过程有重要意义。
总之，CFSE染色方法可以通过荧光示踪技术追踪和分析细胞的增殖和分裂过程。
通过上述实验步骤，可以成功地进行CFSE染色实验，并通过荧光显微镜观察和分析染色细胞的活动状态。
这项技术在生物学、生物医学和药物研发等领域有着广泛的应用前景。
体内CTL方法
体内CTL方法
1．将1 mg CFSE（MW 557.46）溶解于358.77 ul DMSO中，制备成5mM的储存液，分装成20ul/管，置于－20℃保存；
2．取naïve 小鼠脾细胞，以含2％胎牛血清的Hank液将PBMC按2×107细胞/ml重悬，将脾细胞分成2等份，分别用等体积低浓度的CFSE（1.0uM）和高浓度的CFSE（10uM）染色，37℃避光轻摇染色10min；
（注：染色液迅速往细胞内加，使细胞同时染上色）
3．用等体积的胎牛血清终止反应，1000rpm离心5min，弃上清，用含2％胎牛血清的Hank液洗2次，计数；
4．以2×107/ml重悬于含2％胎牛血清的Hank液中，高浓度的CFSE（10uM）染色的细胞进行肽（1-10ug/ml）孵育，低浓度的CFSE（1.0uM）染色的细胞不进行肽孵育，37℃ 5％CO2培养4小时；
5．将细胞转入15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，洗细胞2－3次；6．将低浓度和高浓度CFSE染色的靶细胞等体积混合，按每只小鼠1×107细胞/100ul由眼底毛细血管注射到实验小鼠体内，进行体内细胞杀伤反应；7．杀伤15小时（或更长时间，根据试验决定）后，处死实验小鼠，避光分离得到脾细胞，筛网过滤后转入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析；8．杀伤率＝【1－（试验组的比率/naïve的比率）】×100，
比率＝percentage CFSE high/percentage CFSE low。
1。
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
解刨小鼠提取脾细胞实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过解刨小鼠，提取脾细胞，以便进行后续的免疫学研究。
二、实验材料和仪器
1. 实验材料：小白鼠、生理盐水、70%乙醇、福尔马林、石蜡等。
2. 实验仪器：手术刀、注射器、组织培养皿、显微镜等。
三、实验步骤
1. 解剖小白鼠：将小白鼠放入无菌条件下，用70%乙醇消毒表面。
然后用手术刀在胸部进行切口，打开胸腔，找到心脏，将心脏割断。
接
着将小白鼠向上抬起头部，用手术刀在颈部进行切口，打开颈部皮肤
和肌肉层，在颈动脉两侧夹住气管和食管，并清除周围组织。
最后将
气管和食管割断，并将颈动脉及其分支全部割断。
2. 取出脾脏：用注射器注入生理盐水，将脾脏从周围组织中分离出来，然后将脾脏放入组织培养皿中加入生理盐水洗涤。
3. 细胞处理：将清洗干净的脾脏放入福尔马林中固定30分钟，再用酒精和石蜡等物质进行包埋。
最后用显微镜观察并提取细胞。
四、实验结果
通过本实验，成功地解剖出小白鼠，并提取了脾细胞。
经过显微镜观察，我们可以看到细胞形态正常，并且数量充足。
五、实验注意事项
1. 实验操作要求严格无菌。
2. 解剖小白鼠时要保持手术刀的锋利度。
3. 在取出脾脏时要注意不要损伤其结构。
4. 细胞处理过程中要避免污染。
六、实验结论
通过本实验，我们成功地解剖了小白鼠并提取了脾细胞。
这为后续的免疫学研究奠定了基础。
同时，在操作过程中也需要注意无菌和仪器使用等方面的细节。
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
小鼠脾细胞分离+CFSE染色步骤
小鼠脾脏淋巴细胞分离与CFSE染色步骤
实验材料：小鼠1只、组织剪1把、镊子2把、75%酒精、小鼠固定板、1640培养液（10%FBS，1%双抗）、含0.1%FBS的PBS溶液（无菌）、PBS溶液（无菌）、ACK溶液（无菌）、移液管、枪头、组织研磨棒（无菌）、12孔细胞培养板、15mL离心管、300目尼龙网（无菌），细胞计数板，手术台布。
实验前准备工作：
做好上述实验器具的灭菌工作；将手术台布裹在小鼠固定板上，喷75%酒精，组织剪和镊子用75%酒精浸泡后置于生物安全柜中紫外照射30min；
实验步骤：
1. 取一只6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，将其全部浸泡于75%酒精中5min。
2. 取出小鼠将其固定于固定板上，用组织剪和镊子沿小鼠腹白线剪开腹腔，拨开小肠在腹腔左上方紧贴小肠部位取褐红色长条型脾脏，用组织剪剪开筋膜同时不要把脾脏剪破，将取下的脾脏用PBS冲洗两遍，剪去脾脏上连接的结缔组织。
3. 将脾脏转移入组织研磨棒中，向其中加入2mLPBS溶液后研磨三下，尽量不残留较大组织块；再用3ml PBS冲洗研磨棒后，将脾脏研磨液经300目尼龙网过滤至15mL离心管中，再用2ml PBS冲洗研磨器内壁，同样过滤至15mL离心管中，离心500g，5min。
4. 弃上清后，加入2mL 常温ACK，轻微吹打，裂解红细胞1min 后加入等体积（2mL）PBS 终止裂解，轻微吹打细胞混匀后离心500g，5min。
CFSE染色开始：
5. 弃上清，用4ml PBS（0.1%FBS）重新混匀细胞，反复吹打为单细胞悬液，再用300目尼龙网过滤。
取10μL细胞液于细胞计数板上计数，并将细胞浓度调至1.0×107/ml。
6. 提前将CFSE按照说明书配成5mM母液并2ul分装储存于-80冰箱备用，其工作浓度为0.5-25μM.
7. 分出一部分细胞加入24孔板中，用于做CFSE空白对照
8. 2μlCFSE + 6ml浓度1.0×107/ml的细胞，工作浓度约为1.67μM，37℃，10min，避光。
9. 加入等体积（ice-cold）含血清1640培养基（10%FBS）终止反应，混匀后冰上孵育5min，再离心：500g，5min；
10. 弃上清，用不含血清1640培养基洗细胞一次；
11. 用6ml不含血清培养基（混合TP5或者Tα1或TP5-Myr）重悬细胞沉淀，充分吹打成单细胞悬液，铺12孔板，每孔1ml，孵育2h 后再加100ul FBS至终浓度为10%；
11. 37℃，5%CO2培养3-5天后用流式细胞仪分析细胞488nm 激光器检查细胞增殖情况。